【摘要】：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是動物腸道中的一種具有代表性的益生菌添加劑,豬β防御素-2(pBD-2)和抗菌肽cecropin P1是豬腸道中重要的兩種抗菌肽,動物腸道中的益生菌和抗菌肽在維持腸道菌群平衡,調(diào)節(jié)機(jī)體免疫以及防御病原菌方面起重要作用。利用基因工程方法制備表達(dá)抗菌肽的益生菌將有利于畜禽的生長和提高抗病力。本研究試圖制備表達(dá)豬pBD-2和cecropin P1抗菌肽的枯草芽孢桿菌,以提高仔豬抗病力和促進(jìn)仔豬的生長。為提高抗菌肽的表達(dá)水平,根據(jù)枯草芽孢桿菌偏愛密碼子對β防御素-2和cecropin P1基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化,并將優(yōu)化后的β防御素-2和cecropin P1的基因插入到pMK4原核表達(dá)載體Lac啟動子下游,構(gòu)建成β防御素-2和cecropin P1基因的融合表達(dá)載體pMK-BD-2/CP1,經(jīng)轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌,篩選出表達(dá)融合抗菌肽的枯草芽孢桿菌工程菌。經(jīng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)證明構(gòu)建的工程菌能夠表達(dá)豬β防御素-2和cecropin P1融合抗菌肽,表達(dá)的融合抗菌肽對工程菌的生長沒有明顯影響。融合抗菌肽經(jīng)腸激酶酶切處理后釋放的pBD-2、cecropin P1對多種細(xì)菌都具有明顯的抗菌作用,包括革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、副豬嗜血桿菌)和革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)。動物實(shí)驗(yàn)證實(shí),在仔豬基礎(chǔ)日糧中添加此工程菌可明顯促進(jìn)斷奶仔豬的生長和提高仔豬抗病力。這項研究不僅為該工程菌在養(yǎng)豬業(yè)的應(yīng)用打下了必要的基礎(chǔ)。同時也為其它重組抗菌肽益生菌的制備提供了重要科學(xué)依據(jù)。
[Abstract]:Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) is a representative probiotic additive in animal intestines. Porcine 尾 -defensin -2 (pBD-2) and antimicrobial peptide cecropin P1 are two important antimicrobial peptides in pig intestine. Probiotics and antimicrobial peptides in animal intestine play an important role in maintaining the balance of intestinal flora, regulating body immunity and defending pathogenic bacteria. The preparation of probiotics expressing antimicrobial peptides by genetic engineering will be beneficial to the growth of livestock and poultry. The purpose of this study was to prepare Bacillus subtilis expressing pBD-2 and cecropin P1 antimicrobial peptides in order to improve the disease resistance of piglets and promote the growth of piglets. In order to improve the expression of antimicrobial peptides, 尾 -defensin -2 and cecropin P1 genes were codon optimized according to the preference codon of Bacillus subtilis. The optimized 尾 defensin 2 and cecropin P1 genes were inserted into the downstream of Lac promoter of pMK4 prokaryotic expression vector, and the fusion expression vector pMK-BD-2/CP1, of 尾 defensin 2 and cecropin P1 gene was transformed into Bacillus subtilis. An engineering strain of Bacillus subtilis expressing a fusion of antimicrobial peptides was screened out. The fermentation experiments showed that the recombinant strain could express porcine 尾 -defensin -2 and cecropin P1 fusion antimicrobial peptides, and the expressed fusion antimicrobial peptides had no significant effect on the growth of engineering bacteria. PBD-2,cecropin P1 released by recombinant antimicrobial peptide digested by enterokinase has obvious antimicrobial activity against a variety of bacteria, including Gram-negative bacteria (E. coli, Salmonella typhimurium). Haemophilus parasuis and Gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus). Animal experiments showed that adding this engineering bacterium to the basal diet of piglets could significantly promote the growth of weaned piglets and improve the disease resistance of piglets. This study not only laid a foundation for the application of the engineering bacteria in pig industry. It also provides an important scientific basis for the preparation of other recombinant antimicrobial peptide probiotics.
【學(xué)位授予單位】：燕山大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S816

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本文編號：2216971