【摘要】：豬瘟(Classical swine fever,CSF),是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一種以急性、高熱、免疫抑制和全身泛發(fā)性出血為主要特征的豬的烈性傳染病,又名豬霍亂,俗稱“爛腸瘟”。豬瘟是接觸性高度傳染性疫病,傳播快、致死率高,不同年齡段和品種的豬均可感染,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將豬瘟定為一種必須上報(bào)的動(dòng)物傳染病,我國(guó)也將其列為一類動(dòng)物疫病。豬瘟病毒是有囊膜的單股正鏈RNA病毒,屬于黃病毒科瘟病毒屬成員。NS5A蛋白是豬瘟病毒的一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白,對(duì)于豬瘟病毒的復(fù)制起到重要作用,也是豬瘟病毒復(fù)制復(fù)合體的組成部分。本文主要圍繞CSFV NS5A蛋白和宿主細(xì)胞胞內(nèi)蛋白DDX5(RNA解旋酶DDX5,RNA-helicase p68),研究?jī)烧咧g的相互作用以及DDX5蛋白對(duì)豬瘟病毒基因組復(fù)制的影響,本實(shí)驗(yàn)得到以下結(jié)果:1.設(shè)計(jì)引物通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcription PCR,RT-PCR)在SUVEC(swine umbilical vein endothelial cell line,永生化豬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞)中克隆得到DDX5基因,并連上Myc標(biāo)簽,將帶Myc標(biāo)簽的DDX5基因連入真核表達(dá)載體pCDNA3.1中,得到重組質(zhì)粒pCDNA3.1-DDX5-Myc,在此基礎(chǔ)上同時(shí)構(gòu)建了慢病毒過(guò)表達(dá)載體CMV-DDX5和帶紅色熒光真核表達(dá)載體pDsREDN1-DDX5,經(jīng)質(zhì)粒PCR、雙酶切以及測(cè)序鑒定正確后用于后續(xù)試驗(yàn)。2.將重組質(zhì)粒pCDNA3.1-DDX5-Myc轉(zhuǎn)入SUVEC細(xì)胞通過(guò)Western-blot檢測(cè)DDX5蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果表明DDX5在SUVEC細(xì)胞中可以穩(wěn)定表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,在SUVEC細(xì)胞中共轉(zhuǎn)pCDNA3.1-DDX5-Myc與實(shí)驗(yàn)室保存的pCDNA3.1-NS5A-Flag質(zhì)粒,利用Co-IP方法證明了DDX5蛋白和NS5A蛋白的相互作用。3.在SUVEC細(xì)胞中,共轉(zhuǎn)pDsREDN1-DDX5與實(shí)驗(yàn)室保存的pDsGFPN1-NS5A,利用激光共聚焦方法證明了NS5A和DDX5在細(xì)胞中存在共定位現(xiàn)象。4.通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)通過(guò)慢病毒介導(dǎo)過(guò)表達(dá)DDX5對(duì)CSFV基因組復(fù)制的影響,證明DDX5對(duì)豬瘟病毒基因組的復(fù)制有著明顯的促進(jìn)作用。本研究得到了重組質(zhì)粒pCDNA3.1-DDX5-Myc、CMV-DDX5和pCDNA3.1-DDX5-RedN1,并確定了DDX5和NS5A存在相互作用,在細(xì)胞中存在共定位,并進(jìn)一步在基因水平證明了DDX5對(duì)豬瘟病毒基因組的復(fù)制有著促進(jìn)作用,這為研究宿主細(xì)胞蛋白DDX5在豬瘟病毒增殖中的作用提供了新的科學(xué)資料。
[Abstract]:CSFV) is a severe infectious disease of pigs characterized by acute, high fever, immunosuppression and systemic generalized hemorrhage. It is also known as swine cholera, commonly known as "plague". Swine fever is a highly contagious infectious disease of contact, with high mortality and rapid transmission. Pigs of different ages and breeds can be infected. The (OIE) of the World Organization of Animal Health has designated hog fever as an animal epidemic that must be reported. Our country also listed it as a kind of animal disease. Swine Fever virus (CSFV) is a single-stranded positive RNA virus with envelope. The NS5A protein is a non-structural protein of CSFV, which plays an important role in the replication of CSFV. It is also part of the CSFV replication complex. In this paper, the interaction between CSFV NS5A protein and host cell intracellular protein DDX5 (RNA helicase DDX5 CSFV NS5A p68) and the effect of DDX5 protein on the genomic replication of CSFV were studied. The results were as follows: 1. The DDX5 gene was cloned from SUVEC (swine umbilical vein endothelial cell line, immortalized porcine umbilical vein endothelial cells by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), and the DDX5 gene with Myc tag was inserted into the eukaryotic expression vector pCDNA3.1. The recombinant plasmid pCDNA3.1-DDX5-Myc was obtained, and the lentivirus overexpression vector CMV-DDX5 and the red fluorescent eukaryotic expression vector pDsREDN1-DDX5 were constructed simultaneously. The recombinant plasmid pCDNA3.1-DDX5-Myc was transferred into SUVEC cells to detect the expression of DDX5 protein by Western-blot. The results showed that DDX5 could be expressed stably in SUVEC cells. On the basis of these results, pCDNA3.1-DDX5-Myc was co-transformed into pCDNA3.1-NS5A-Flag plasmids preserved in laboratory in SUVEC cells. The interaction between DDX5 protein and NS5A protein was proved by Co-IP method. In SUVEC cells, the co-transfer of pDsREDN1-DDX5 and pDsGFPN1-NS5A was carried out. The co-localization of NS5A and DDX5 in the cells was proved by laser confocal method. The effect of lentivirus mediated overexpression of DDX5 on the replication of CSFV genome was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. It was proved that DDX5 could promote the replication of CSFV genome. In this study, the recombinant plasmids pCDNA3.1-DDX5-Mycton-CMV-DDX5 and pCDNA3.1-DDX5-RedN1 were obtained, and the interaction between DDX5 and NS5A was confirmed, and the co-localization in cells was confirmed. Furthermore, it was proved at the gene level that DDX5 could promote the replication of CSFV genome, and the recombinant plasmid pCDNA3.1-DDX5-CMV-DDX5 and pCDNA3.1-DDX5-RedN1 were obtained. This provides new scientific data for the study of the role of host cell protein DDX5 in the proliferation of classical swine fever virus (CSFV).
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.651

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本文編號(hào)：2183167