發(fā)布時間：2018-07-26 17:49

【摘要】：Kisspeptin是KiSS-1基因編碼的一種多肽,其在下丘腦表達(dá),對哺乳動物生殖活動起中樞調(diào)控作用已被廣泛證實。研究表明,Kisspeptin除在下丘腦表達(dá)外,在卵巢也有表達(dá),但有關(guān)其功能和機(jī)制的研究極少。對豬和鼠的研究發(fā)現(xiàn),Kisspeptin參與卵母細(xì)胞成熟,但其作用存在種屬差異。牛卵母細(xì)胞上是否有Kisspeptin表達(dá),其功能和機(jī)制如何,目前還不清楚。本文首先利用免疫熒光和熒光定量PCR技術(shù)研究了體外成熟過程Kisspeptin及其受體GPR54在牛卵母細(xì)胞中的分布定位及表達(dá)規(guī)律,隨后研究了添加外源Kisspeptin對牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響及其相關(guān)機(jī)制,研究結(jié)果主要分以下2部分:1.收集不同培養(yǎng)時間(0、6、12、18、24h)的牛卵母細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色,隨后于倒置熒光顯微鏡下觀察。研究結(jié)果表明:Kisspeptin在卵母細(xì)胞整個體外成熟過程中均有表達(dá),且表達(dá)位置相同。但由細(xì)胞的熒光強(qiáng)度可知,不同時間點的Kisspeptin表達(dá)量存在差異。收集不同培養(yǎng)時間(0、6、12、18、24h)的卵母細(xì)胞,利用熒光定量PCR,檢測KiSS-1、GPR54基因表達(dá)量,研究結(jié)果表明,KiSS-1及GPR54基因的表達(dá)量均在0h最高,隨體外培養(yǎng)過程出現(xiàn)波動性變化,且變化曲線較為相似。2.按照添加外源Kisspeptin的濃度不同將培養(yǎng)液分為5組,分別為TCM-199對照組、添加1nmol/L、10nmol/L、102nmol/L、103nmol/L Kisspeptin的處理組,用5種培養(yǎng)液進(jìn)行卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)并統(tǒng)計成熟率,成熟率最高組的Kisspeptin濃度為添加Kisspeptin的最適濃度。結(jié)果顯示,添加10nmol/L Kisspeptin組的細(xì)胞成熟率極顯著高于其他4組(P0.01),確定10nmol/L為添加外源Kisspeptin的最適濃度。按照培養(yǎng)液的不同處理方式將其分為8組,分別為①TCM-199②TCM-199+Kisspeptin③TCM-199+FSH④TCM-199+FSH+Kisspeptin⑤TCM-199+Kisspeptin+FBS⑥TCM-199+FBS⑦TCM-199+Kisspeptin+p234⑧TCM-199+p234+FSH,用8種培養(yǎng)液進(jìn)行卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)并統(tǒng)計成熟率。結(jié)果顯示,Kisspeptin組與Kisspeptin+FSH組的卵母細(xì)胞成熟率較高,兩組間差異不顯著,但均極顯著高于FBS組(P0.01);同時添加FBS和Kisspeptin時,成熟率較低,與Kisspeptin組差異極顯著(P0.01);同時添加Kisspeptin和p234,成熟率顯著低于Kisspeptin組(P0.05);同時添加FSH和p234,成熟率與FSH組無顯著差異。利用熒光定量PCR檢測體外成熟過程中(12、24h)卵母細(xì)胞發(fā)育關(guān)鍵基因BMP15和GDF9的表達(dá)量。結(jié)果顯示,BMP15和GDF9在12、24h表達(dá)量較低,但用添加Kisspeptin的培養(yǎng)液進(jìn)行體外培養(yǎng)時,BMP15和GDF9的表達(dá)量顯著上升,說明Kisspeptin可以促進(jìn)成熟調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)。
[Abstract]:Kisspeptin is a polypeptide encoded by KiSS-1 gene. It is expressed in hypothalamus and plays a central role in the regulation of mammalian reproductive activity. The results showed that Kisspeptin was expressed not only in the hypothalamus but also in the ovary, but the function and mechanism of Kisspeptin were seldom studied. It was found that Kisspeptin was involved in oocyte maturation in pigs and mice, but its effects were different in species. It is unclear whether there is Kisspeptin expression in bovine oocytes and its function and mechanism. The distribution, localization and expression of Kisspeptin and its receptor GPR54 in bovine oocytes during maturation in vitro were studied by immunofluorescence and fluorescence quantitative PCR. The effect of exogenous Kisspeptin on bovine oocyte maturation in vitro and its related mechanism were studied. The results were divided into two parts: 1. Bovine oocytes were collected and stained with immunofluorescence for different culture time (0 ~ 6 ~ 12 ~ 1 ~ 18 ~ 24 h), and then observed under inverted fluorescence microscope. The results showed that: Kisspeptin was expressed in the whole process of oocyte maturation in vitro, and expressed in the same position. However, according to the fluorescence intensity of the cells, there were differences in the expression of Kisspeptin at different time points. The expression of KiSS-1GPR54 gene was detected by fluorescence quantitative PCR. the results showed that the expression of KiSS-1 and GPR54 genes were the highest in 0 h, and fluctuated with the process of culture in vitro, and the curve was similar. According to the concentration of exogenous Kisspeptin, the culture medium was divided into five groups: TCM-199 control group, treated with 1nmol / L 102nmol / L nmol / L Kisspeptin. The oocytes were cultured in vitro with five kinds of culture medium and the maturation rate was calculated. The Kisspeptin concentration of the highest maturation rate group was the optimum concentration of adding Kisspeptin. The results showed that the maturation rate of cells in the 10nmol/L Kisspeptin group was significantly higher than that in the other four groups (P0.01). The optimum concentration of 10nmol/L was determined as the addition of exogenous Kisspeptin. They were divided into 8 groups according to the different treatment methods of culture medium, 1TCM-1992TCM-199 Kisspeptin3TCM-199 FSH4TCM-199 FSH Kisspeptin5TCM-199 Kisspeptin FBS6TCM-199 FBS7TCM-199 Kisspeptin p2348TCM-199 p234FSH.The oocytes were cultured in vitro with 8 kinds of culture medium and the maturation rate was calculated. The results showed that the maturation rate of oocytes in Kisspeptin group and Kisspeptin FSH group was higher than that in FBS group (P0.01), and the maturation rate was lower when FBS and Kisspeptin were added at the same time. Compared with the Kisspeptin group, the maturation rate was significantly lower than that of the Kisspeptin group (P0.05), and the maturation rate of the FSH group was not significantly different from that of the FSH group with the addition of FSH and p234 (P0.01), and the addition of Kisspeptin and p234 was significantly lower than that of the Kisspeptin group (P0.05). Fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression of BMP15 and GDF9, the key genes of oocyte development during in vitro maturation (1224 h). The results showed that the expression of BMP15 and GDF9 was low at 1224 h, but the expression of BMP15 and GDF9 in cultured medium supplemented with Kisspeptin increased significantly, indicating that Kisspeptin could promote the expression of key genes in maturation.
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S823

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本文編號：2146801