本文選題：黑腹果蠅 + 小RNA測(cè)序��； 參考：《南京師范大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：果蠅(Drosophila melanogaster)作為重要的模式動(dòng)物,其便捷的遺傳可操作性、完備的基因組注釋以及豐富的突變株種類(lèi),為研究果蠅免疫穩(wěn)態(tài)的調(diào)控機(jī)制提供了極大的便利,也為研究昆蟲(chóng)天然免疫與人類(lèi)天然免疫之間的關(guān)系架起了橋梁。果蠅先天免疫響應(yīng)主要包括兩個(gè)不同的信號(hào)通路: Toll和Imd信號(hào)通路,這兩個(gè)信號(hào)通路分別與哺乳動(dòng)物先天免疫應(yīng)答過(guò)程中的TLR信號(hào)通路和TNF-α信號(hào)通路具有同源性,表明果蠅與哺乳動(dòng)物在先天免疫調(diào)控途徑上存在著共同的進(jìn)化起源。因此,深入開(kāi)展果蠅免疫調(diào)控機(jī)制的研究,為進(jìn)一步揭示其他昆蟲(chóng)抗病原菌感染的作用機(jī)制,以及闡明哺乳動(dòng)物先天性免疫的調(diào)控機(jī)制等都具有重要的理論和實(shí)踐意義。microRNA (miRNA)是與轉(zhuǎn)錄后基因沉默相關(guān)的一類(lèi)長(zhǎng)度為21～25nt的非編碼小RNA,在基因表達(dá)調(diào)控以及維持生物體內(nèi)穩(wěn)態(tài)過(guò)程中都起著極其重要的作用。當(dāng)免疫應(yīng)答被過(guò)度激活或不足時(shí),將會(huì)對(duì)生物個(gè)體造成不同程度的損傷。因此,生物體必須具備相應(yīng)的保護(hù)機(jī)制來(lái)維持免疫穩(wěn)態(tài),以防止免疫應(yīng)答因過(guò)度或不足所造成的傷害。果蠅Toll信號(hào)通路作為果蠅免疫應(yīng)答的重要通路之一,其調(diào)控過(guò)程必定是一個(gè)十分精細(xì)的過(guò)程,涉及的調(diào)控因子可能既有各種信號(hào)通路蛋白、轉(zhuǎn)錄因子,亦有多種miRNA參與其中。然而,目前有關(guān)miRNA在果蠅Toll信號(hào)通路中的調(diào)控作用范圍及調(diào)控作用機(jī)制仍不十分清晰,需作進(jìn)一步的深入研究。為此,本論文圍繞miRNA在果蠅Toll信號(hào)通路中的調(diào)控機(jī)制這一重要科學(xué)問(wèn)題,開(kāi)展了較為系統(tǒng)的研究工作:1.利用small RNA-seq技術(shù),考察了革蘭氏陽(yáng)性菌藤黃微球菌(M.luteus)感染野生型果蠅(w1118)3 h、12 h和24 h后的果蠅及未感染的野生型果蠅(w1118,對(duì)照)的miRNA表達(dá)情況,共計(jì)鑒定出445個(gè)果蠅miRNA;感染M.luteus 3 h和12 h后的果蠅與對(duì)照組果蠅比較,分別出現(xiàn)了 6和14個(gè)差異表達(dá)的miRNA,而感染24 h后的果蠅差異表達(dá)的miRNA數(shù)量則顯著增加到86個(gè)。2.為了對(duì)潛在的免疫應(yīng)答相關(guān)的miRNA進(jìn)行篩選和鑒定,利用果蠅全身高表達(dá)系統(tǒng)Gal80ts-tub-Gal4,構(gòu)建了 41株UAS-miRNA lines果蠅高表達(dá)品系,在所有的果蠅高表達(dá)品系中共包含了之前分析得到的93個(gè)差異表達(dá)miRNA中的60個(gè)miRNA。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知,其中有8個(gè)miRNA極可能參與了革蘭氏陽(yáng)性菌激活的果蠅Toll信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控過(guò)程。這8個(gè)miRNA分別是:miR-310家族的 miR-310、miR-311、miR-312、miR-313 及 miR-317、miR-963、miR-964和 miR-958。3.為了考察miR-958和miR-310家族分子負(fù)調(diào)控果蠅Toll信號(hào)通路的作用機(jī)制,利用miRanda、PITA和Targetscan三個(gè)靶基因預(yù)測(cè)軟件,分別預(yù)測(cè)了miR-958和miR-310家族分子在果蠅全基因組范圍內(nèi)的靶基因。分析結(jié)果顯示,miR-958調(diào)控果蠅Toll信號(hào)通路的潛在靶基因是Toll和Dif,miR-310家族分子調(diào)控果蠅Toll信號(hào)通路的潛在靶基因是Toll、Cactus和Drosomycin。4.采用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)對(duì)miR-958和miR-310家族分子的潛在靶基因進(jìn)行了鑒定。鑒定結(jié)果顯示,miR-958可以與靶基因Toll和Dif相互作用,而miR-310家族分子只能與靶基因Drosomycin相互作用,卻不能和另外兩個(gè)預(yù)測(cè)的靶基因Toll和Cactus相互作用。5.通過(guò)qRT-PCR和Western Blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn),成簇的miR-310～313的表達(dá)比單個(gè)miR-310家族分子的表達(dá)對(duì)抗菌肽Drosomycin抑制作用更強(qiáng),表明這種同家族分子共同作用的形式對(duì)于miR-310家族調(diào)控果蠅Toll信號(hào)通路具有重要意義;而miR-958的表達(dá)能夠同時(shí)顯著抑制Toll和Dif的蛋白表達(dá)水平,表明miRNA在調(diào)控果蠅Toll信號(hào)通路中展現(xiàn)出了豐富的空間性和層次性。本論文的研究結(jié)果表明,miRNA在果蠅Toll信號(hào)免疫響應(yīng)中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用,其中miR-310家族分子是通過(guò)直接抑制果蠅Toll信號(hào)通路激活產(chǎn)生的抗菌肽分子Drosomycin的表達(dá)來(lái)調(diào)控果蠅的免疫應(yīng)答,而miR-958則是通過(guò)抑制Toll信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因Toll和Dif的表達(dá),間接負(fù)調(diào)節(jié)了抗菌肽Drosomycin表達(dá)。這些研究結(jié)果不僅揭示了 miR-958和miR-310家族分子的新功能和調(diào)控模式,而且亦揭示了它們調(diào)控Toll信號(hào)通路的主要分子機(jī)制。
[Abstract]:In this paper , it is important to study the regulation mechanism of the immune response of flies and human beings . The results indicate that there are two different signaling pathways : Toll and Imd signaling pathway . In order to investigate the role of miR - 958 and miR - 310 family molecules in controlling Drosophila Toll - signaling pathway , the expression of miR - 958 and miR - 310 family molecules in Drosophila Toll - signaling pathway has been identified .
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S852.4

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本文編號(hào)：2113957