本文選題：H9N2亞型禽流感病毒 + NS1蛋白��； 參考：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：H9N2禽流感NS1蛋白是該病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白,而且是一種多功能調(diào)節(jié)蛋白,能夠抵制流感病毒感染所引發(fā)的宿主免疫反應(yīng),而且還可以導(dǎo)致多種傳代細(xì)胞凋亡。在我們之前的研究中已經(jīng)證實(shí),H9N2禽流感病毒NS1蛋白能夠誘導(dǎo)DF-1細(xì)胞發(fā)生凋亡。為了研究H9N2禽流感病毒NS1蛋白是否能夠引起氧化應(yīng)激以及氧化應(yīng)激在其致凋亡作用中的影響,我們將質(zhì)粒pEGFP-NS1轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞不同時(shí)間后,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧的累積情況及氧化還原信號(hào)的變化;將pEGFP-NS1轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞48小時(shí),并設(shè)置空白對(duì)照組、空載體對(duì)照組以及抗氧化劑(PTDC和NAC)處理組,探索氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。研究結(jié)果如下:1.H9N2禽流感病毒NS1蛋白能夠引起DF-1細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激。我們于熒光顯微鏡下觀察活性氧陰離子探針紅色熒光發(fā)現(xiàn),在pEGFP-NS1轉(zhuǎn)染24小時(shí)后ROS的產(chǎn)生開始增多,并隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加,通過流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)這一結(jié)果;超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性的檢測(cè)結(jié)果表明,兩者的活性都隨著pEGFP-NS1轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)升高;相對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)PRDX3和TRX的mRNA表達(dá)水平結(jié)果顯示,pEGFP-NS1轉(zhuǎn)染24小時(shí)開始,兩者均有不同程度的下調(diào)。2.氧化應(yīng)激促進(jìn)H9N2禽流感病毒NS1蛋白誘導(dǎo)的DF-1細(xì)胞凋亡過程。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組、空載體對(duì)照組、pEGFP-NS1轉(zhuǎn)染48小時(shí)、PTDC/NAC預(yù)處理的pEGFP-NS1轉(zhuǎn)染組共5組細(xì)胞。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),各組凋亡率為:2.4%、4.0%、15.8%、12.8%、6.8%,抗氧化劑處理組細(xì)胞凋亡率明顯低于實(shí)驗(yàn)組;caspase-3、caspase-8、caspase-9活性檢測(cè)結(jié)果,抗氧化劑處理組細(xì)胞的caspase-3、caspase-9活性均降低,caspase-8活性變化不明顯;Western Blotting檢測(cè)活化的caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax及bcl-2的蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn),與caspases活性檢測(cè)結(jié)果相一致,抗氧化劑處理后活化的caspase-3、caspase-9的表達(dá)量降低,caspase-8表達(dá)量變化不明顯,抗氧化劑處理后Bax的表達(dá)比實(shí)驗(yàn)組低,而bcl-2則比實(shí)驗(yàn)組要高。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了H9N2禽流感病毒NS1蛋白能夠誘導(dǎo)DF-1細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激,且氧化應(yīng)激參與其誘導(dǎo)的DF-1凋亡過程。且氧化應(yīng)激可能通過內(nèi)源性凋亡路徑(線粒體依賴性凋亡途徑)對(duì)H9N2禽流感病毒NS1蛋白誘導(dǎo)的DF-1細(xì)胞凋亡過程進(jìn)行調(diào)節(jié)。
[Abstract]:H9N2 avian influenza NS1 protein is a non-structural protein of the virus and a multifunctional regulatory protein which can resist the host immune response caused by influenza virus infection and can induce apoptosis of many passage cells. Our previous studies have confirmed that H9N2 avian influenza virus NS1 protein can induce apoptosis in DF-1 cells. In order to study whether NS1 protein of H9N2 avian influenza virus can induce oxidative stress and the effect of oxidative stress on apoptosis, we transfected the plasmid pEGFP-NS1 into DF-1 cells for different time. After transfection of pEGFP-NS1 into DF-1 cells for 48 hours, blank control group, empty carrier control group and antioxidant treatment group (PTDC and NAC) were set up. To explore the effect of oxidative stress on apoptosis. The results are as follows: 1. The NS1 protein of H9N2 avian influenza virus can induce oxidative stress in DF-1 cells. We observed the red fluorescence of reactive oxygen species anion probe under fluorescence microscope and found that Ros production began to increase after 24 hours of pEGFP-NS1 transfection and increased with time. This result was further confirmed by flow cytometry. The activity of superoxide dismutase and catalase increased with the prolongation of pEGFP-NS1 transfection time, and the mRNA expression level of PRDX3 and TRX by relative fluorescence quantitative PCR showed that pEGFP-NS1 transfection began 24 hours after transfection. Both have varying degrees of down-regulation. Oxidative stress promotes apoptosis of DF-1 cells induced by NS1 protein of H9N2 avian influenza virus. In this experiment, blank control group and empty vector control group pEGFP-NS1 were transfected with pEGFP-NS1 pretreated with PTDC / NAC for 48 hours. By flow cytometry, the apoptotic rate of each group was 1: 2. 4%. The apoptosis rate of the antioxidant treated group was significantly lower than the activity of caspase-3, caspase-8, caspase-8 and caspase-9 in the antioxidant treatment group, and the apoptotic rate was 12. 8% and 12. 8% respectively, and the apoptosis rate of the antioxidant treatment group was significantly lower than that of the experimental group. The activities of caspase-3, caspase-9 and caspase-9 in antioxidant treated cells were not significantly changed. Western blotting was used to detect the expression of caspase-3, caspase-8, caspase-9, Bax and bcl-2, which was consistent with the results of caspases activity test. The expression of activated caspase-3 and caspase-9 after antioxidant treatment had no significant change. The expression of Bax was lower than that of experimental group, but the expression of bcl-2 was higher than that of experimental group. In conclusion, this study confirmed that NS1 protein of H9N2 avian influenza virus can induce oxidative stress in DF-1 cells, and oxidative stress participates in the process of DF-1 apoptosis induced by H9N2 avian influenza virus. Oxidative stress may regulate the apoptosis of DF-1 cells induced by NS1 protein of H9N2 avian influenza virus through endogenous apoptosis pathway (mitochondrial dependent apoptosis pathway).
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2097093