本文選題：法氏囊活性肽BP5 + 雞DT40細(xì)胞��； 參考：《河南科技大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：法氏囊(bursa of Fabricus,BF)是禽類特有的體液中樞免疫器官,負(fù)責(zé)B細(xì)胞的發(fā)育和抗體的分泌。法氏囊活性肽BP5(Bursopentin)是從雞BF中分離到的一種新的免疫活性肽,不僅能夠調(diào)節(jié)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng),還具有抗氧化和抗腫瘤活性。目前,BP5抗腫瘤的作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在利用噬菌體展示技術(shù),結(jié)合BP5誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)譜分析及生物信息學(xué)分析,以期篩選出BP5腫瘤細(xì)胞相互作用蛋白并對其進(jìn)行初步鑒定,同時(shí)初步揭示BP5抗腫瘤作用機(jī)制。本研究主要包括以下三個(gè)方面的內(nèi)容:1、法氏囊BP5特異性結(jié)合肽的篩選及鑒定利用噬菌體展示技術(shù),以BP5-BSA為靶分子對噬菌體隨機(jī)12肽庫進(jìn)行4輪親和篩選,結(jié)合ELISA鑒定和競爭抑制試驗(yàn),篩選出3個(gè)BP5特異性結(jié)合肽,分別為:PINMQTLNCMAA(P2-12)、GCTLNPMSDLLG(P6-12)和MSSTLNGMLNSL(P7-12),其核心基序?yàn)門LNXM。采用MTT法檢測其對BP5抗腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響,結(jié)果顯示,P2-12和P7-12肽在0.2-20μg/mL下,P6-12在2-20μg/mL濃度下均能抑制BP5抗小鼠WEHI-231細(xì)胞增殖作用,其中P2-12在2-20μg/mL濃度下抑制作用最顯著(p0.01)。此外,p53熒光素酶檢測活性結(jié)果顯示,3種BP5結(jié)合肽在實(shí)驗(yàn)濃度下均能下調(diào)BP5促p53基因轉(zhuǎn)錄活性。表明這3種BP5特異性結(jié)合肽均能下調(diào)BP5的抗腫瘤活性。為研究BP5的抗腫瘤作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。2、雞DT40細(xì)胞c DNA T7噬菌體文庫的構(gòu)建及BP5雞DT40細(xì)胞相互作用蛋白的篩選以雞DT40細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞模型,利用T7噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建雞DT40細(xì)胞cDNA T7噬菌體文庫,并以BP5-BSA為靶分子對文庫進(jìn)行親和篩選,結(jié)合序列測定和生物信息學(xué)分析,篩選BP5雞DT40細(xì)胞相互作用蛋白。結(jié)果顯示,構(gòu)建的雞DT40細(xì)胞cDNA T7噬菌體文庫原始滴度為1.2×104 pfu/mL,擴(kuò)增后滴度達(dá)1.9×109 pfu/m L,文庫重組率為91.7%,且插入片段大多在250-1000bp。隨機(jī)選取12個(gè)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序,結(jié)果顯示插入序列均為雞源序列。通過II三輪親和淘選,結(jié)合序列測定獲得3條與BP5結(jié)合的雞源蛋白運(yùn)輸?shù)鞍最w粒復(fù)合體2(TRAPPC2,trafficking protein particle complex 2)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA,vascular endothelial growth factor A)和細(xì)胞周期蛋白E1(CCNE1,cyclin E1)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)雞的TRAPPC2與小鼠和人的TRAPPC2的同源相似性分別為97.9%、100%,雞的VEGFA與小鼠和人的VEGFA的同源相似性分別為76.8%、74.1%,雞的CCNE1與小鼠和人的CCNE1的同源相似性分別為67.3%、71.3%,其中,VEGFA是血管生成的重要調(diào)控因子,CCNE1是調(diào)控細(xì)胞周期G1/S期的重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白,二者的異常表達(dá)均與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),提示BP5的抗腫瘤作用可能與VEGFA和CCNE1相關(guān),為進(jìn)一步研究BP5腫瘤細(xì)胞相互作用蛋白提供科學(xué)依據(jù)。3、BP5刺激的雞DT40細(xì)胞基因表達(dá)譜分析以BP5刺激雞DT40細(xì)胞,通過基因芯片技術(shù)來分析BP5刺激后雞DT40細(xì)胞中基因表達(dá)譜的變化情況。結(jié)果顯示,BP5參與調(diào)節(jié)多條與抗腫瘤功能有關(guān)的通路,其中包括p53信號通路,且p53信號通路涉及的5個(gè)差異表達(dá)基因均與細(xì)胞周期調(diào)控或抗腫瘤相關(guān),其中SIAH1、TP53(p53)、CIP1(p21)基因被上調(diào),CHEK2、CCNE1基因被下調(diào)。BP5依賴p53腫瘤信號通路分析結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)錄水平上,BP5在0.2-20μg/mL濃度下能夠明顯提高HCT116細(xì)胞中p53相對Luciferase活性,在蛋白表達(dá)水平上,BP5能顯著促進(jìn)p53、p21蛋白的表達(dá)水平,顯著降低CCNE1和CHEK2蛋白的表達(dá)水平。結(jié)合BP5雞DT40細(xì)胞相互作用蛋白篩選結(jié)果,初步鑒定為CCNE1是BP5腫瘤細(xì)胞相互作用蛋白候選蛋白,為進(jìn)一步研究BP5抗腫瘤作用的分子機(jī)制提供了重要的依據(jù)。
[Abstract]:A novel immunoactive peptide was isolated from chicken BF by using phage display technology . The results showed that the BP5 - specific binding peptide could downregulate BP5 ' s anti - tumor activity . Vascular endothelial growth factor A ( VEGFA , vascular endothelial growth factor A ) and cyclin E1 ( CCNE1 , cyclin E1 ) . The results showed that BP5 was involved in regulating the expression level of p53 and p21 protein . The results showed that BP5 could significantly improve the expression of p53 and p21 protein . The results showed that BP5 could significantly improve the expression of p53 and p21 protein .
【學(xué)位授予單位】：河南科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S857.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2071158