本文選題：NLRX1 + LUBAC　； 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：蛋白翻譯后的泛素化修飾在調(diào)節(jié)各種細(xì)胞生物功能的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。近幾年新發(fā)現(xiàn)的線性泛素鏈組裝復(fù)合體(linear ubiquitin chain assembly complex,LUBAC)由HOIP、HOIL-1L和SHARPIN組成,能夠產(chǎn)生一種新型的Met1連接的線性多聚泛素鏈,可以特異性調(diào)控經(jīng)典的NF-κB信號(hào)通路,是天然免疫反應(yīng)的重要組成部分。NLRs是一類重要的胞漿型模式識(shí)別受體(PRR),負(fù)責(zé)識(shí)別細(xì)胞內(nèi)信號(hào),是固有免疫針對(duì)病原微生物的一類重要感受器。NLRX1是NLRs家族中唯一定位于線粒體的成員,結(jié)構(gòu)較為保守,能夠通過(guò)多種途徑參與NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控,而NLRX1對(duì)LUBAC介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用尚未有人報(bào)道。因此,本論文以NLRX1為研究對(duì)象,初步探討了其對(duì)LUBAC介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的影響,并進(jìn)一步解釋其作用機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容如下:1.NLRX1抑制LUBAC誘導(dǎo)的NF-κB啟動(dòng)子活化在HEK-293T細(xì)胞中,分別轉(zhuǎn)染LUBAC、NF-κB-Luc、pRL-TK和不同劑量的NLRX1真核表達(dá)質(zhì)粒,雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NLRX1能夠顯著抑制LUBAC激活的NF-κB啟動(dòng)子活性,并且呈劑量依賴性。說(shuō)明NLRX1能夠負(fù)調(diào)控LUBAC介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路。2.從互作角度探究NLRX1和LUBAC的關(guān)系LUBAC由HOIL-1L、HOIP和SHARPIN組成,為了探究NLRX1負(fù)調(diào)控LUBAC介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的作用機(jī)制,我們首先從互作角度探究NLRX1和LUBAC的關(guān)系。通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(CO-IP)發(fā)現(xiàn),超表達(dá)條件下NLRX1與HOIL-1L、HOIP和SHARPIN均存在相互作用,但生理?xiàng)l件下,NLRX1只與HOIP存在互作,且NLRX1是通過(guò)其NOD結(jié)構(gòu)域與HOIP的UBA結(jié)構(gòu)域互作;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)NLRX1能夠抑制LUBAC復(fù)合物的形成,減少LUBAC對(duì)NEMO的招募。3.NLRX1發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域?yàn)長(zhǎng)RR結(jié)構(gòu)域?yàn)榱颂骄縉LRX1發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域,構(gòu)建了NLRX1的4個(gè)截短突變體,NLRX1-N-ter(1-468bp)、NLRX1-ΔN-ter(469-2928bp)、NLRX1-LRR(976-2928bp)和NLRX1-ΔLRR(1-975bp)。用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NLRX1的LRR結(jié)構(gòu)域在負(fù)調(diào)控LUBAC依賴的NF-κB通路中發(fā)揮著重要作用。4.NLRX1對(duì)LUBAC定位及表達(dá)的影響利用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA)檢測(cè)NLRX1對(duì)LUBAC定位的影響,發(fā)現(xiàn)NLRX1和LUBAC存在共定位且定位于胞漿,NLRX1對(duì)LUBAC的定位幾乎沒(méi)有影響。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)表明NLRX1也不影響LUBAC的mRNA水平;Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NLRX1特異性抑制HOIP的表達(dá),且呈劑量依賴性,但用MG132處理后,與對(duì)照組相比,HOIP的表達(dá)得到恢復(fù),表明NLRX1介導(dǎo)的HOIP的降解是通過(guò)蛋白酶體途徑實(shí)現(xiàn)的。5.NLRX1抑制NEMO的線性泛素化修飾在LUBAC介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路中,LUBAC能夠招募NEMO并對(duì)其進(jìn)行線性泛素化修飾,引起IKK復(fù)合物的活化及IκBα的降解,促使NF-κB的釋放和入核。為了驗(yàn)證NLRX1降解HOIP的生物學(xué)意義,通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NLRX1對(duì)內(nèi)源性NEMO的線性泛素化的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NLRX1能夠抑制內(nèi)源性NEMO的線性泛素化修飾,進(jìn)而負(fù)調(diào)控LUBAC介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路。
[Abstract]:Ubiquitin modification after protein translation plays a key role in regulating the biological functions of various cells. The newly discovered linear ubiquitin chain assembly complex (linear ubiquitin chain assembly complexLUBAC) is composed of HOIPHIOIL-1L and SHARPIN. It can produce a new type of Met1-linked linear polyubiquitin chain, which can specifically regulate the classical NF- 魏 B signaling pathway. NLRs are important cytosolic pattern recognition receptors (PRR) that recognize intracellular signals. NLRX1 is the only member of the NLRs family that is located in mitochondria, and its structure is conserved, and it can participate in the regulation of NF- 魏 B signaling pathway through many ways. The regulation of NLRX1 on LUBAC mediated NF- 魏 B signaling pathway has not been reported. Therefore, NLRX1 is taken as the research object in this paper. The effects of NLRX1 on the NF- 魏 B signaling pathway mediated by LUBAC are preliminarily discussed, and the mechanism of NLRX1 is further explained. The main results were as follows: 1. NLRX1 inhibited the activation of NF- 魏 B promoter induced by LUBAC in HEK-293T cells and transfected LUBAC- 魏 B-LucpRL-TK and different doses of NLRX1 eukaryotic expression plasmids respectively. The double luciferase reporting system showed that NLRX1 could significantly inhibit the activity of NF- 魏 B promoter activated by LUBAC. And in a dose-dependent manner. NLRX1 can negatively regulate the NF- 魏 B signaling pathway mediated by LUBAC. To explore the relationship between NLRX1 and LUBAC from the perspective of interaction, LUBAC is composed of HOIL-1LHIP and SHARPIN. In order to explore the mechanism of NLRX1 negatively regulating the NF- 魏 B signaling pathway mediated by LUBAC, we first explored the relationship between NLRX1 and LUBAC from the perspective of interaction. The results of co-immunoprecipitation assay (CO-IP) showed that NLRX1 interacted with HOIL-1LLHIP and SHARPIN under over-expression condition, but NLRX1 only interacted with HoIP under physiological conditions, and NLRX1 interacted with HoIP's UBA domain through its nod domain. It was also found that NLRX1 could inhibit the formation of LUBAC complex and reduce the recruitment of Nemo by LUBAC. 3. The key domain of NLRX1 to play a negative regulatory role was LRR domain. Four truncated mutants of NLRX1, NLRX1-N-ter (1-468bp), NLRX1- 螖 N-ter (469-2928bp), NLRX1-LRR (976-2928bp) and NLRX1- 螖 LRR (1-975bp) were constructed. The LRR domain of NLRX1 played an important role in the negative regulation of LUBAC dependent NF- 魏 B pathway. 4. The effect of NLRX1 on LUBAC localization and expression was detected by indirect immunofluorescence assay (IFA). It was found that NLRX1 and LUBAC were colocated and the localization of NLRX1 in cytoplasm had little effect on the localization of LUBAC. Fluorescence quantitative PCR assay showed that NLRX1 did not affect the mRNA level of LUBAC. Western blot analysis showed that NLRX1 specifically inhibited the expression of HoIP in a dose-dependent manner, but the expression of HOIP recovered after treatment with MG132. It is suggested that NLRX1-mediated HOIP degradation is mediated by the proteasome pathway. 5. NLRX1 inhibits the linear ubiquitin modification of Nemo in LUBAC mediated NF- 魏 B signaling pathway, and LUBAC can recruit and modify Nemo by linear ubiquitin modification. Ik complex was activated and I 魏 B 偽 degraded, NF- 魏 B was released and nucleated. In order to verify the biological significance of NLRX1 degradation of hop, the effect of NLRX1 on the linear ubiquitin of endogenous Nemo was detected by immunoprecipitation. The results showed that NLRX1 could inhibit the linear ubiquitin modification of endogenous Nemo. Furthermore, the LUBAC mediated NF- 魏 B signaling pathway was negatively regulated.
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.4

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本文編號(hào)：2067485