發(fā)布時間：2018-06-25 20:53

  本文選題：豬繁殖與呼吸綜合征病毒 + 基因合成�。� 參考：《中國獸醫(yī)科學(xué)》2017年07期

【摘要】：根據(jù)已測定的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)GSWW分離株的全長基因組序列信息,采用合成生物學(xué)的方法,將全長基因組序列分為兩段(7 636 bp和7 774 bp)分別連接到低拷貝載體p BR-322載體中,然后將2個半長片段相連接得到全長c DNA克隆。將質(zhì)粒線性化后,體外轉(zhuǎn)錄獲得全長RNA,經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞拯救獲得了初代病毒。將初代病毒接種感染Marc-145細(xì)胞進(jìn)行傳代,接毒后第36小時即可觀察到完全的致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。通過RT-PCR、間接免疫熒光、測序驗證,證明成功獲得了PRRSV GSWW株的感染性克隆。通過實時熒光定量法檢測拯救病毒與原田間分離毒的復(fù)制能力,沒有顯著差異,采用實時熒光定量法測得的拯救病毒復(fù)制的最高效價為1×1010copies/m L。本研究表明,采用長片段基因合成的方法進(jìn)行PRRSV感染性克隆的構(gòu)建,方法可行且速度快,為PRRSV流行毒感染致病機理、免疫機制和基于反向遺傳學(xué)的新型疫苗研制提供了重要的分子工具。
[Abstract]:According to the information of the full-length genome sequence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSv) GSWW isolate, the synthetic biology method was used. The full length genomic sequence was divided into two segments (7 636 BP and 7 774 BP), respectively, which were ligated to the low copy vector pBR-322, and then two half long fragments were ligated to obtain the full length cDNA clone. After the plasmid was linearized, the full-length RNAs were obtained by transcription in vitro, and the primary virus was obtained by electroporation transfection into BHK21 cells. The primary virus was inoculated into Marc-145 cells for passage, and the complete cytopathogenic effect (CPE) was observed 36 hours after inoculation. The infectious clone of PRRSv GSWW strain was successfully obtained by RT-PCR, indirect immunofluorescence and sequencing. There was no significant difference between the replicating ability of the rescue virus and the original virus isolated in the field by real-time fluorescence quantitative method. The highest titer of the replicating of the rescue virus was 1 脳 1010copies/m / L measured by the real-time fluorescence quantitative method. The results showed that the construction of PRRSv infectious clone by long fragment gene synthesis was feasible and rapid, which was the pathogenic mechanism of PRRSv infection. Immune mechanisms and the development of new vaccines based on reverse genetics provide important molecular tools.
【作者單位】： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室;
【基金】：甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項目(GNSW-2009-10) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程經(jīng)費資助
【分類號】：S852.651

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本文編號：2067434