發(fā)布時間：2018-06-20 22:59

  本文選題：犬DEA.血型 + 單鏈抗體(scFv)�。� 參考：《農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報》2017年06期

【摘要】：在我國缺乏用于犬(Canis lupus familiaris)血型鑒定的檢測試劑,本研究目的在于制備犬DEA1.1血型鑒定抗體,為寵物犬輸血前血型鑒定提供材料。本研究以比格犬為研究對象,以外周血淋巴細(xì)胞為抗體基因來源,設(shè)計犬抗體可變區(qū)基因簡并引物,用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)合成cDNA,擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)(heavy chain variable region gene,VH)和輕鏈可變區(qū)(light chain variable region gene,VL)基因,用重疊延伸PCR將VH和VL通過Linker連接重組單鏈抗體(single chain antibody variable fragment,scFv)的基因片段,將scFv基因連接至噬菌體載體pCANTAB 5E,構(gòu)建犬源單鏈抗體scFv文庫,用斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附測定(dot enzyme-linked immunosorbent assay,Dot-ELISA)方法和犬紅細(xì)胞抗原1.1(dog erythrocyte antigen 1.1,DEA1.1)血型免疫庫為基礎(chǔ),進(jìn)行3輪篩選。以鑒定陽性的克隆為基礎(chǔ),構(gòu)建了原核表達(dá)重組單鏈抗體蛋白。結(jié)果表明,犬抗體可變區(qū)簡并引物有效可用,并成功構(gòu)建犬源單鏈抗體scFv文庫。構(gòu)建的免疫庫實(shí)際庫容量為7×10~5,具有多樣性和足夠大的庫容量。最終篩選到3株能夠與犬DEA1.1血型抗原相結(jié)合的單鏈抗體。檢測鑒定原核表達(dá)的Clone16蛋白為可溶蛋白。親和純化獲得Clone16單鏈抗體進(jìn)一步用臨床樣本驗(yàn)證,具有較強(qiáng)結(jié)合特性。本研究為制備犬DEA1.1血型鑒定試劑提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:The purpose of this study was to prepare DEA1.1 blood group identification antibody in dogs and to provide materials for blood group identification before blood transfusion in pet dogs. In this study, the degenerate primers of variable region gene of dog antibody were designed with peripheral blood lymphocytes as the source of antibody gene. CDNAs were synthesized by reverse transcriptionpolymerase chain reactionin reverse polymerase chain reaction (RT-PCR). The heavy chain variable region gene (VH) and the light chain variable region (LVC) gene were amplified. VH and VL were linked to the recombinant single chain antibody variable fragment FV by overlapping extension PCR. The scFv gene was ligated to the phage vector pCANTAB5E, and a canine scFv library was constructed. Three rounds of screening were carried out on the basis of dot-ELISA-dot enzyme-linked immunosorbent assay and 1.1(dog erythrocyte antigen 1.1 DEA1.1) blood group immunological library. Based on the positive clones, prokaryotic expression of recombinant scFv protein was constructed. The results showed that the degenerate primers of canine antibody variable region were effective and the canine scFv library was successfully constructed. The actual capacity of the constructed immune library is 7 脳 10 ~ (5), with diversity and large enough capacity. Finally, three single chain antibodies (scFv) which could bind to DEA1.1 blood group antigen were screened. The prokaryotic expression of Clone16 protein was identified as soluble protein. Clone16 scFV was obtained by affinity purification and further validated by clinical samples, with strong binding properties. This study provides a theoretical basis for the preparation of DEA1.1 blood group identification reagent in dogs.
【作者單位】： 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(No.31502138和No.31572590) 山東省自然科學(xué)基金(No.BS2015NY001) 山東省高校計劃項(xiàng)目(No.J15LF03)
【分類號】：S852.4

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本文編號：2046006