本文選題：禽流感 + 乳酸菌　； 參考：《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：禽流感(Avian influenza,AI)是全球范圍內(nèi)廣為流行的禽類急性高度傳染性疾病之一,近幾十年來(lái)不僅給我國(guó)的養(yǎng)禽業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失、而且引起威脅人類健康的嚴(yán)重公共衛(wèi)生學(xué)問題。目前,接種疫苗仍然是控制禽流感的最有效的方法,由于傳統(tǒng)的疫苗多為滅活疫苗,雖安全性較好、但其免疫效果不理想,所以研制新型的口服黏膜免疫的通用型微生物制劑將具有更廣闊的應(yīng)用前景。本研究選用乳酸菌作為外源蛋白的遞送載體,將禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的血凝素基因HA2與主要保護(hù)性抗原M2e蛋白基因融合在一起,研制了HA2融合M2e基因的重組新功能型乳酸菌并對(duì)其免疫效果進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:(1)乳酸菌p SIP409-pgs A-3M2e-HA2、p SIP409-pgs A-HA2的制備及反應(yīng)原性分析本文通過(guò)酶切、連接、轉(zhuǎn)化等方法制備了兩個(gè)重組質(zhì)粒p SIP409-pgs A-3M2e-HA2和質(zhì)粒p SIP409-pgs A-HA2。將該質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入受體菌植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)NC8中,并用誘導(dǎo)肽Spp IP誘導(dǎo)表達(dá),利用Western blotting分析乳酸菌表達(dá)蛋白的反應(yīng)原性,結(jié)果表明新功能型乳酸菌p SIP409-pgs A-3M2e-HA2和p SIP409-pgs A-HA2所表達(dá)的外源蛋白均具有良好的反應(yīng)原性,為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。(2)乳酸菌pSIP409-pgsA-3M2e-HA2和pSIP409-pgsA-HA2免疫保護(hù)效果比較與評(píng)價(jià)將實(shí)驗(yàn)雛雞分6組,每組20只。分別將已成功制備的p SIP409-pgs A-3M2e-HA2和p SIP409-pgs A-HA2兩組乳酸菌和本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建的p SIP409-pgs A-3M2e和的p SIP409-pgs A共四種乳酸菌對(duì)雛雞進(jìn)行初次免疫和加強(qiáng)免疫,同時(shí)設(shè)計(jì)空白對(duì)照組與H9N2亞型禽流感滅活疫苗組。初免從21天開始,連續(xù)3天,間隔14天之后加強(qiáng)免疫,連續(xù)3天。間隔3天后殺雞取樣,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)各組雛雞脾臟中的T淋巴細(xì)胞的活化與增殖情況,從而來(lái)檢測(cè)新功能型乳酸菌對(duì)雛雞的免疫保護(hù)效果。此外,分別收取各組雛雞的血清和氣管灌洗液,并用間接ELISA方法檢測(cè)雛雞特異性的Ig G抗體和分泌型抗體SIg A(Secretory immunoglobulin A,SIg A)的表達(dá)水平。雛雞加強(qiáng)免疫后一周后通過(guò)滴鼻方式感染鶴源和鴨源兩種不同源的H9N2亞型禽流感病毒,攻毒后觀察雛雞的精神狀態(tài)并記錄雛雞的體重變化。攻毒后10天宰殺雛雞并取肺臟和喉頭,制成病理切片,通過(guò)HE染色觀察并比較肺臟和喉頭病理變化。更進(jìn)一步檢測(cè)并評(píng)價(jià)新功能型乳酸菌對(duì)雛雞的免疫保護(hù)效果。結(jié)果顯示,雛雞口服免疫新功能型乳酸菌p SIP409-pgs A-3M2e-HA2、p SIP409-pgs A-HA2和p SIP409-pgs A-3M2e后雛雞的脾臟中的T淋巴細(xì)胞數(shù)量相比空白對(duì)照組顯著增高,其中p SIP409-pgs A-3M2e-HA2組和p SIP409-pgs A-HA2組差異極顯著(P0.001)。血清及氣管灌洗液中的特異性抗體的表達(dá)水平p SIP409-pgs A-3M2e-HA2組和p SIP409-pgs A-HA2組差異極顯著(P0.05)。觀察和比較各組雛雞感染病毒后精神狀態(tài)結(jié)果顯示p SIP409-pgs A-3M2e-HA2組和p SIP409-pgs A-HA2組雛雞先呈現(xiàn)精神不振、采食量下降等狀態(tài),但隨后逐漸恢復(fù)正常,而空白對(duì)照組則持續(xù)呈現(xiàn)發(fā)病狀態(tài)。感染兩種病毒后雛雞體重變化規(guī)律基本相同,結(jié)果顯示p SIP409-pgs A-3M2e-HA2和p SIP409-pgs A-HA2組雛雞體重開始逐漸下降,第6天達(dá)到最低,隨后體重開始增加,而空白對(duì)照組雛雞體重持續(xù)下降。肺臟及喉頭病理切片結(jié)果顯示p SIP409-pgs A-3M2e-HA2和p SIP409-pgs A-HA2組雛雞的病理癥狀較輕。以上結(jié)果表明新功能型乳酸菌對(duì)H9N2亞型流感病毒的不同毒株均有保護(hù)作用,并且p SIP409-pgs A-3M2e-HA2和p SIP409-pgs A-HA2乳酸菌的免疫保護(hù)效果更好。說(shuō)明HA2作為禽流感病毒的血凝素的保守抗原針對(duì)不同的禽H9N2亞型流感病毒都有較強(qiáng)的保護(hù)效果,同時(shí)發(fā)現(xiàn)了共表達(dá)M2e基因的融合新功能型乳酸菌更能增強(qiáng)機(jī)體抵抗AIV攻擊的能力,以上結(jié)果為研制抗禽流感的新功能型微生態(tài)制劑提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:Avian influenza (AI) is one of the most popular avian acute infectious diseases in the world. In recent decades, it has not only caused serious economic losses to the poultry industry in China, but also caused serious public health problems threatening human health. At present, vaccination is still the most effective way to control avian influenza. Because the traditional vaccine is mostly inactivated vaccine, although the safety is good, but its immune effect is not ideal, so the development of a new type of oral mucosal immune general microbial preparation will have a wider application prospect. This study selects the lactic acid bacteria as the delivery carrier of foreign protein and Avian influenza virus (AIV). The fusion of the hemagglutinin gene HA2 and the main protective antigen M2e protein gene has been developed and the recombinant new functional lactic acid bacteria with HA2 fusion M2e gene are developed and its immune effect is preliminarily evaluated. The specific contents and results are as follows: (1) the preparation of P SIP409-pgs A-3M2e-HA2, the preparation of P SIP409-pgs A-HA2 and the analysis of the reactivity Two recombinant plasmids P SIP409-pgs A-3M2e-HA2 and plasmid P SIP409-pgs A-HA2. were prepared by over enzyme digestion, connection and transformation. The plasmid was transferred into the NC8 of Lactobacillus plantarum (Lactobacillus plantarum), and was induced by inducible peptide Spp IP. The exogenous proteins expressed in the new functional lactic acid bacteria P SIP409-pgs A-3M2e-HA2 and P SIP409-pgs A-HA2 all have good reactivity and lay the foundation for the next experiment. (2) the comparison and evaluation of the immune protection effect of lactic acid bacteria pSIP409-pgsA-3M2e-HA2 and pSIP409-pgsA-HA2, the experimental chickens were divided into 6 groups, each group was 20. SIP409-pgs A-3M2e-HA2 and P SIP409-pgs A-HA2 two groups of lactic acid bacteria, P SIP409-pgs A-3M2e and P SIP409-pgs A four kinds of lactic acid bacteria were first immunized and strengthened in chicks. At the same time, the blank control group and the H9N2 subtype avian influenza inactivated vaccine group were designed. The initial immunity began from 21 days, 3 days in a continuous period and 14 days interval. After 3 days of immunization, the chickens were sampled for 3 days. The activation and proliferation of T lymphocytes in the spleen of the chickens were detected by flow cytometry and lymphocyte proliferation, so as to detect the protective effect of the new functional Lactobacillus on the chickens. ELISA method was used to detect the expression level of Ig G antibody and secretory antibody SIg A (Secretory immunoglobulin A, SIg A). After a week of immunization, chickens infected with two different sources of the crane source and duck source were infected with the H9N2 subtype of avian influenza virus. After attack, the spirit state of the chicks was observed and the body weight changes of the chicks were recorded. 10 days after the attack, the chicks were slaughtered and the lungs and larynx were taken to make pathological sections. HE staining was used to observe and compare the pathological changes of the lungs and larynx. The immune protection effect of the new functional lactic acid bacteria to the chicks was further detected and evaluated. The results showed that the chickens were immunized with new functional lactic acid bacteria P SIP409-pgs A-3M2e-HA2, P SIP409-pgs A-H The number of T lymphocytes in the spleen of A2 and P SIP409-pgs A-3M2e was significantly higher than that in the blank control group, and the difference between the P SIP409-pgs A-3M2e-HA2 group and P SIP409-pgs A-HA2 group was very significant (P0.001). Very significant (P0.05). Observation and comparison of the mental state of chickens infected with virus in each group showed that the chicks of the P SIP409-pgs A-3M2e-HA2 group and the P SIP409-pgs A-HA2 group first presented the state of discomfort and feed intake, but then gradually recovered to normal, while the blank control group continued to appear in the present state. The change of the body weight of the chickens after the two viruses was infected. The rules were basically the same, the results showed that the body weight of P SIP409-pgs A-3M2e-HA2 and P SIP409-pgs A-HA2 group began to decline gradually, the sixth days reached the lowest, then the body weight began to increase, while the blank control group of chick body weight continued to decrease. The pathological section of lung and throat pathology showed the pathology of P SIP409-pgs A-3M2e-HA2 and P SIP409-pgs A-HA2 group. The above results showed that the new functional lactobacillus has protective effect on different strains of H9N2 subtype influenza virus, and the immune protection effect of P SIP409-pgs A-3M2e-HA2 and P SIP409-pgs A-HA2 lactic acid bacteria is better. It shows that HA2 as the conserved antigen of the hemagglutinin of avian influenza virus is directed against the different avian influenza virus of different avian influenza viruses It has a strong protective effect. At the same time, the new functional lactic acid bacteria, which co express M2e gene, can enhance the ability of resisting AIV attack. The above results provide a theoretical basis for the development of new functional microecosystem for anti avian influenza.
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S855.3

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本文編號(hào)：2043556