本文選題：亮氨酸 + 骨骼肌��； 參考：《華中農業(yè)大學》2017年碩士論文

【摘要】：仔豬早期斷奶措施會導致仔豬出現早期斷奶應激反應,誘導仔豬骨骼肌、肝臟和脾臟發(fā)生自噬。自噬是一種在進化上高度保守的分解代謝過程,參與到細胞的多個生理和病理過程,如生長發(fā)育、分化、代謝、免疫、炎癥和凋亡。亮氨酸不僅是蛋白質合成的底物,還可以通過mTORC1、Sestrin2和谷氨酸脫氫酶等信號通路發(fā)揮調節(jié)細胞自噬的功能。因此,亮氨酸對細胞自噬的調控機制有待進一步研究,以期為斷奶仔豬的精準飼養(yǎng)提供新的研究資料。本研究通過對早期斷奶仔豬分別飼喂1.66%和2.10%亮氨酸水平的日糧,在21日齡、22日齡和26日齡各選取3頭仔豬進行屠宰,取其背最長肌樣品,運用蛋白質組學iTRAQ技術鑒定仔豬骨骼肌中的差異表達蛋白,并篩選受亮氨酸調節(jié)的關鍵自噬相關蛋白。在仔豬骨骼肌中共鑒定到蛋白質1919個,差異表達蛋白402個,且特有肽段數、肽段序列長度和肽段序列覆蓋率都符合質譜測序標準。差異表達蛋白的GO分析結果顯示,差異表達蛋白主要分布在細胞內組分和細胞器部分,參與營養(yǎng)物質的代謝過程,主要發(fā)揮結合與催化功能。差異表達蛋白代謝通路分析顯示,蛋白質合成相關的信號通路顯著增強,包括eIF2、eIF3E、eIF5、eEF1信號通路和40S核糖體相關蛋白等。通過Western blot驗證發(fā)現,無論是mTOR的活性,還是其下游底物S6K1的活性都顯著增強。同時,與能量合成相關的氧化磷酸化通路中的F0F1-ATP合成酶、NADH脫氫酶、鐵硫蛋白,三羧酸循環(huán)通路中的順烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、酮戊二酸脫氫酶、琥珀酰輔酶A,糖酵解通路中的丙酮酸激酶,磷酸戊糖途徑中的磷酸葡萄糖異構酶的含量都顯著升高。通過高效液相色譜法也發(fā)現在試驗組中,AMP含量極顯著降低,ADP含量顯著降低,ATP含量顯著升高,AMP/ATP比值極顯著降低。最后,我們篩選到CAPNS1、RACK1和PRKAR1A三個自噬相關蛋白,且在斷奶應激誘導自噬反應的過程中CAPNS1、RACK1和PRKAR1A的表達量都顯著升高。另外,在26日齡試驗組中,p-AMPK的含量顯著下降,p-mTOR的含量顯著升高。因此,亮氨酸可以激活仔豬骨骼肌中的多條能量合成途徑,很可能通過抑制AMPK的活性,增強mTOR的活性,并抑制RACK1的表達,最終起到抑制自噬的作用。綜上所述,得出以下結論:(1)2.10%的亮氨酸水平日糧促進斷奶仔豬骨骼肌中蛋白質合成相關的信號通路,包括mTOR信號通路和eIF2信號通路等;(2)2.10%的亮氨酸水平日糧促進斷奶仔豬骨骼肌中的能量合成,極顯著降低AMP含量,顯著提高ATP含量;(3)斷奶應激可以誘導自噬發(fā)生,顯著提高CAPNS1、RACK1和PRKAR1A的表達量;(4)亮氨酸很可能通過AMPK-mTOR信號通路抑制RACK1的表達,發(fā)揮抑制細胞自噬的功能。
[Abstract]:Early weaning can lead to early weaning stress and induce autophagy in skeletal muscle liver and spleen of piglets. Autophagy is an evolutionarily conserved catabolism process, which is involved in many physiological and pathological processes, such as growth, differentiation, metabolism, immunity, inflammation and apoptosis. Leucine is not only a substrate for protein synthesis, but also regulates autophagy through signal pathways such as mTORC1Sestrin2 and glutamate dehydrogenase. Therefore, the regulation mechanism of leucine on autophagy needs to be further studied in order to provide new data for precision feeding of weaned piglets. In this study, three piglets were slaughtered at the age of 21 days, 22 days old and 26 days old respectively, and the longissimus dorsi muscle samples were collected by feeding 1. 66% and 2. 10% leucine level of early weaning piglets respectively. Differential expression proteins in skeletal muscle of piglets were identified by proteomics iTRAQ technique and the key autophagy related proteins regulated by leucine were screened. A total of 1919 proteins and 402 differentially expressed proteins were identified in skeletal muscle of piglets. Go analysis of the differential expression protein showed that the differential expression protein mainly distributed in the intracellular components and organelles, participated in the metabolism of nutrients and played a major role in the binding and catalytic functions. The metabolic pathway analysis of differentially expressed proteins showed that the signal pathways associated with protein synthesis were significantly enhanced, including eIF2eIF3EIF3EIF5EF1 signaling pathway and 40s ribosomal associated protein. Western blot analysis showed that both the activity of mTOR and the activity of substrates S6K1 were significantly increased. At the same time, the F0F1-ATP synthase nadh dehydrogenase, ferrithionein, cisaconitase, isocitrate dehydrogenase, succinate dehydrogenase, ketoglutarate dehydrogenase, isocitrate dehydrogenase, ketoglutarate dehydrogenase were found in the oxidative phosphorylation pathway associated with energy synthesis. The contents of succinyl coenzyme A, pyruvate kinase in glycolysis pathway and phosphoglucose isomerase in pentose phosphate pathway were significantly increased. It was also found by HPLC that the content of AMP in the experimental group was very significantly decreased, the content of ADP was significantly decreased, the content of ATP was significantly increased and the ratio of AMP / ATP was significantly decreased. Finally, three autophagy related proteins, CAPNS1, RACK1 and PRKAR1A, were screened, and the expression levels of CAPNS1, RACK1 and PRKAR1A were significantly increased during the induction of autophagy response under weaning stress. In addition, the content of p-AMPK in 26 days old group decreased significantly, and the content of p-mTOR increased significantly. Therefore, leucine can activate multiple energy synthesis pathways in skeletal muscle of piglets, which may inhibit autophagy by inhibiting the activity of AMPK, enhancing the activity of mTOR and inhibiting the expression of RACK1. To sum up, the following conclusions can be drawn: 1% of leucine level diet promotes the signal pathway related to protein synthesis in skeletal muscle of weaned piglets. 2.10% leucine level diet including mTOR signaling pathway and eIF2 signaling pathway promoted energy synthesis in skeletal muscle of weaned piglets, significantly reduced AMP content, significantly increased ATP content and induced autophagy. Leucine could inhibit the expression of RACK1 and PRKAR1A through AMPK-mTOR signaling pathway and inhibit the function of autophagy.
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S828.5

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本文編號：2016717