本文選題：禽致病性大腸桿菌 + 非編碼小RNA�。� 參考：《安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：禽致病性大腸桿菌(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)能引起禽類(lèi)局部或全身性的急性、慢性感染,因其毒力因子的復(fù)雜性,給養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展帶來(lái)了嚴(yán)重的危害。近年來(lái),人們提出了非編碼小RNA(small non-coding regulatory RNA,sRNA),作為一種新發(fā)現(xiàn)的基因調(diào)節(jié)子,其在轉(zhuǎn)錄后可水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。大腸桿菌作為RNA介導(dǎo)調(diào)控的模式病原菌,其自身對(duì)毒力機(jī)制,病原致病機(jī)制、代謝途徑等已進(jìn)行了深入研究。RyhB作為目前調(diào)控靶mRNA數(shù)目最多的小分子RNA之一,鑒于其作為大腸桿菌諸多調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵組成部分,在細(xì)菌的致病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,但是有關(guān)RyhB與禽致病性大腸桿菌致病性及毒力之間的關(guān)系卻未見(jiàn)報(bào)道,因此開(kāi)展RyhB與APEC致病性之間的關(guān)系研究具有重要意義。本研究以sRNA(RyhB)為研究對(duì)象,通過(guò)構(gòu)建APEC缺失株△RyhB和基因回復(fù)株△RyhB-comp,研究基因缺失對(duì)其生物學(xué)特性、毒力因子轉(zhuǎn)錄水平、黏附CEF細(xì)胞能力、半數(shù)致死量以及感染雛雞病理變化的影響,揭示RyhB基因與APEC致病性之間的關(guān)系,為進(jìn)一步研究APEC黏附和侵襲宿主細(xì)胞的致病性功能調(diào)控通路(Pathway)奠定基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:1、禽致病性大腸桿菌RyhB缺失株及回復(fù)株的構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Red同源重組技術(shù),通過(guò)PCR方法將RyhB-Up、RyhB-Down、PKD3-Cm進(jìn)行基因擴(kuò)增,運(yùn)用overlap的方法,擴(kuò)增出RyhB同源重組片段,用于打靶目的序列。利用30℃熱誘導(dǎo)蛋白,將同源重組片段電轉(zhuǎn)入含PKD46的原始出發(fā)株,進(jìn)行目的基因替換。利用氯霉素抗性標(biāo)記篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,將PCP20質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入陽(yáng)性菌株消除氯霉素抗性,經(jīng)PCR驗(yàn)證成功構(gòu)建出APEC野生株RyhB的缺失株△RyhB。同步經(jīng)RyhB基因擴(kuò)增,所得RyhB目的片段和pSTV28載體分別用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切,然后用T4連接酶連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,氯霉素抗性平板篩選陽(yáng)性克隆。將回復(fù)質(zhì)粒pSTV28-RyhB電擊導(dǎo)入△RyhB,經(jīng)CM抗性篩選獲得回復(fù)株△RyhB-comp并經(jīng)PCR驗(yàn)證。2、禽致病性大腸桿菌RyhB缺失株及回復(fù)株生物學(xué)特性的評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)分別從生長(zhǎng)曲線(xiàn)、運(yùn)動(dòng)性能、活性氧的抑制和禽β-防御素6的耐受實(shí)驗(yàn)來(lái)研究禽致病性大腸桿菌RyhB缺失后的生物學(xué)特性差異。結(jié)果顯示:APEC缺失株△RyhB以及回復(fù)株△RyhB-comp對(duì)其生長(zhǎng)性能沒(méi)有顯著影響;RyhB的缺失能顯著降低AE17的運(yùn)動(dòng)性能,構(gòu)建了回復(fù)質(zhì)粒的△RyhB-comp運(yùn)動(dòng)性能有所回復(fù);三株菌對(duì)活性氧的耐壓性沒(méi)有明顯差異,表明RyhB的缺失不影響APEC對(duì)活性氧的耐受性;△RyhB相較AE17,對(duì)禽β-防御素6的耐受能力顯著性下降,回復(fù)株△RyhB-comp的耐受力有所回復(fù)。3、禽致病性大腸桿菌RyhB缺失株及回復(fù)株對(duì)毒力與致病性的分析通過(guò)檢測(cè)毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平、CEF細(xì)胞的黏附力、LD50以及雛雞病理組織變化來(lái)探索APEC RyhB的缺失對(duì)其毒力及致病性的影響。結(jié)果顯示:△RyhB的bcfA、fyuA、tsh、luxS、fimC、ompA毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平均極顯著下降(P0.01),其mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別約為AE17的19%、52%、20%、14%、28%、52%;△RyhB的iss、ibeA毒力基因表達(dá)水平上調(diào)分別約為1.14倍和1.2倍。△RyhB黏附細(xì)胞能力較AE17均有顯著地降低,約為AE17的62.5%,△RyhB-comp相比較△RyhB黏附能力顯著上升,為△RyhB的1.4倍。LD50的結(jié)果顯示,相比AE17,△RyhB的毒力下降了143.5倍,相比△RyhB,△RyhB-comp的毒力有所回復(fù)。雛雞病理學(xué)切片觀察顯示,APEC能引起雛雞心、肝、脾、小腸組織不同程度的壞死、變性,并伴有充血和淤血。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了APEC的缺失株△RyhB和回復(fù)株△RyhB-comp,研究結(jié)果表明,RyhB的缺失能引起APEC的運(yùn)動(dòng)性能降低、禽β-防御素6耐受性下降,毒力基因的表達(dá)水平下調(diào)、CEF細(xì)胞的黏附力減弱及LD50的下降,推測(cè)RyhB對(duì)APEC的毒力及致病性具有極其重要的調(diào)節(jié)作用,為進(jìn)一步研究RyhB對(duì)APEC的致病調(diào)控機(jī)制提供一些理論參考。
[Abstract]:In recent years , we have studied the relationship between RyhB gene and the pathogenic mechanism and metabolic pathway of E . coli . 紱借嚧鐥呮，

本文編號(hào)：2001868