本文選題：雷帕霉素靶蛋白 + 肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2�。� 參考：《內(nèi)蒙古大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：骨骼肌分化過(guò)程是衛(wèi)星細(xì)胞(Satellite cells, SCs)退出細(xì)胞周期融合成為多核肌管的過(guò)程,這個(gè)過(guò)程是肌細(xì)胞決定因子1(Myogenic differentiation 1, MyoD1)調(diào)控肌細(xì)胞生成素(Myogenin, MyoG)的表達(dá)而完成的。同時(shí),肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2 (Myocyte enhancer factor 2, MEF2)結(jié)合于肌肉組織特異性表達(dá)基因的調(diào)控區(qū),增強(qiáng)肌肉組織蛋白的合成。肌細(xì)胞的增殖與分化受到營(yíng)養(yǎng)、激素和自分泌因子的影響。亮氨酸引發(fā)產(chǎn)生的代謝合成信號(hào),促使雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin, mTOR)轉(zhuǎn)移到溶酶體表面進(jìn)而Ras蛋白腦組織同源類(lèi)似物(Ras homolog enriched in brain, Rheb)可以激活它；與此同時(shí),胰島素樣生長(zhǎng)因子1(Insulin like growth factor I, IGF-1)抑制結(jié)節(jié)性硬化癥蛋白復(fù)合物2(Tuberous sclerosis complex 2, TSC2),導(dǎo)致mTOR釋放。激活后的mTOR磷酸化其下游的底物,如真核生物翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白(Eukaryotic initiation factor 4E-binding protein-1,4E-BP1)和核糖體蛋白S6激酶(Ribosomal protein S6 kinase-1, S6K1),刺激肌肉蛋白的合成并促使肌肉肥大。同時(shí),4E-BP1、S6K和蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatases 2A, PP2A)等mTOR底物參與多條信號(hào)通路調(diào)控骨骼肌的發(fā)育。雖然,在骨骼肌發(fā)育過(guò)程中,目前對(duì)于mTOR激活的研究已經(jīng)比較清楚。但是,其下游通過(guò)何種途徑來(lái)調(diào)控MyoD1和MEF2,繼而調(diào)控骨骼肌相關(guān)基因的表達(dá)等方面的研究尚未可知。在本研究中,首先用兩步酶消化法和差速貼壁法分離并純化山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(goat Skeletal satellite cells, gSSCs),并對(duì)其進(jìn)行鑒定和誘導(dǎo)分化。結(jié)果顯示,采用0.1%I型膠原酶和0.25%胰蛋白酶兩步消化法可以有效分離gSSCs,PO代gSSCs差速貼壁培養(yǎng)24h后,有少量細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)；72h后大量的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。用免疫組化法檢測(cè)gSSCs中標(biāo)記基因Desmin、alpha-Actin、MyoD1、生肌調(diào)節(jié)因子5 (Myogenic regulatory factor 5, Myf5)和配對(duì)盒基因7 (Paired box 7,PAX7)的表達(dá)情況,結(jié)果得到的細(xì)胞中這5個(gè)基因表達(dá)均呈陽(yáng)性。成肌誘導(dǎo)后第1d細(xì)胞發(fā)生聚集生長(zhǎng),第3d時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞融合現(xiàn)象而且融合的細(xì)胞折光度較強(qiáng)。第5-7d時(shí)形成粗大的肌管并有分支出現(xiàn),且肌管中表達(dá)快肌肌球蛋白(Fast muscle myosin, FMM)。以分離純化后的gSSCs為細(xì)胞模型探究mTOR信號(hào)通路對(duì)MEF2C的調(diào)控作用。不同濃度的PP242處理gSSCs 3h后,隨著PP242(一種特異性mTOR小分子抑制劑)濃度的增加S6K和MEF2C (S59)磷酸化水平同步降低,而S6K和MEF2C在細(xì)胞中的蛋白總量并沒(méi)有變化。當(dāng)PP242濃度為100 nM時(shí),S6K和MEF2C活性得到很好的抑制。在MEF2C免疫共沉淀產(chǎn)物中,大約50kD處,PP242處理前蛋白量較多,而處理后的蛋白量較少；且該處蛋白中8號(hào)蛋白整合素連接激酶(Integrin linkedkinase, ILK)屬于mTOR信號(hào)通路中的蛋白。用100nM PP242處理gSSCs3h后,ILK的表達(dá)量沒(méi)有明顯變化(P0.05),但其磷酸化水平升高了近1.7倍(1.6816土0.061,P0.05,對(duì)照為1.0±0.054,P0.05)；同時(shí),MEF2C與ILK共定位于gSSCs中。隨著Cpd22(一種特異性ILK小分子抑制劑)濃度的增加ILK的磷酸化水平在降低,而不影響ILK的表達(dá)量。當(dāng)1000nM Cpd22處理gSSCs 3h后,ILK活性得到很好的抑制,而且MEF2C (S59)活性提高了近1.6倍(1.5526土0.054,P0.05),蛋白表達(dá)量并沒(méi)有變化(P0.05)。ILK活性的抑制在一定程度上阻斷mTOR信號(hào)通路對(duì)MEF2C的作用。在體外ILK會(huì)促進(jìn)MEF2C 59位絲氨酸殘基的去磷酸化,且mTOR和ILK都調(diào)控肌酸激酶(MCK)的表達(dá)；與藥物處理結(jié)果一致,shRNA干擾ILK的表達(dá)卻增強(qiáng)了 MEF2C的活性和MCK的表達(dá)。在gSSCs誘導(dǎo)分化過(guò)程中,100 nM PP242極大地抑制了其分化過(guò)程,只有極少數(shù)的細(xì)胞發(fā)生融合,沒(méi)有形成明顯的肌管,且只有0.73%的細(xì)胞發(fā)生融合并表達(dá)肌球蛋白重鏈(Myosin heavy chain,MHC)。在gSSCs誘導(dǎo)時(shí)加入PP242 24h后,S6K的表達(dá)量沒(méi)有明顯變化(P0.05),但其活性受到抑制；MyoD1的表達(dá)量和活性都沒(méi)有受到影響；MyoG的蛋白表達(dá)量(0.3892±0.037,P0.05,Control:1.0034±0.056,P0.05)和mRNA轉(zhuǎn)錄量(0.362±0.019,P0.05,Control: 1.0054±0.057,P0.05)均降低。MyoD1免疫共沉淀后,PP242處理24 h后約90KD位置處的蛋白含量明顯高于對(duì)照組；其中6#蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)和MyoD1共定位于核內(nèi)和胞質(zhì)且相互免疫共沉淀均呈陽(yáng)性。PP242抑制mTOR活性24h后,STAT1的表達(dá)量和磷酸化水平都沒(méi)有受到影響,但是其核內(nèi)含量增加了大約2.3倍(2.3304±0.049,P0.05,對(duì)照組：1.0023±0.065,P0.05)；MyoD1核內(nèi)含量沒(méi)有明顯變化。在誘導(dǎo)過(guò)程中干擾STAT1,STAT1的表達(dá)量急劇降低(0.3016±0.031,P0.05,對(duì)照組：1.0134±0.067,P0.05),但MyoD1的表達(dá)量和磷酸化水平均無(wú)明顯變化,MyoG的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(2.2901±0.081,P0.05)。當(dāng)轉(zhuǎn)染STAT1-shRNA后,PP242對(duì)MyoG的轉(zhuǎn)錄調(diào)控受阻(1.765±0.058,P0.05),但沒(méi)有完全被抑制。基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本研究成功建立了gSSCs體外分離、純化、培養(yǎng)和鑒定的方法,并發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路正調(diào)控MEF2C和負(fù)調(diào)控ILK; ILK負(fù)調(diào)控MEF2C, mTOR通過(guò)調(diào)節(jié)STAT1核內(nèi)含量調(diào)控MyoD1的轉(zhuǎn)錄。研究結(jié)果表明mTOR信號(hào)通路調(diào)控MEF2C的活性及轉(zhuǎn)錄活性,同時(shí)調(diào)控MyoD1的轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)一步調(diào)控gSSCs增殖和分化。
[Abstract]:楠ㄩ鑲屽垎鍖栬繃紼嬫槸鍗槦緇嗚優(yōu)(Satellite cells, SCs)閫，

本文編號(hào)：1974713