本文選題：綿羊 + 卵丘-卵母細胞復合體仿組織��； 參考：《中國農(nóng)業(yè)科學》2017年08期

【摘要】：【目的】在綿羊有腔卵泡發(fā)育過程中,多層卵丘細胞緊密包繞著卵母細胞形成卵丘-卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complex,COCs)特殊結(jié)構(gòu),存在于卵泡腔內(nèi)。卵泡成熟后,綿羊COC從卵泡內(nèi)排出,進入輸卵管,等待受精。現(xiàn)有的卵丘-卵母細胞復合體蛋白鑒定技術(shù),或者將包含各級卵泡的卵巢組織直接進行切片處理,或者將COCs從卵泡內(nèi)分離,在完整卵丘-卵母細胞復合體水平上進行免疫染色。但這兩種方法在檢測綿羊有腔卵泡COCs中目的蛋白表達時,存在顯著缺陷。研究旨在對常規(guī)石蠟組織切片技術(shù)進行改進,以期滿足綿羊COCs蛋白鑒定需求。【方法】首先采用抽吸法從綿羊有腔卵泡內(nèi)獲得COCs,以石蠟包埋方式人為構(gòu)建了一種可以進行切片處理的"包含多枚綿羊卵丘-卵母細胞復合體的仿組織結(jié)構(gòu)"。然后以該特殊結(jié)構(gòu)與健康綿羊卵巢組織為研究對象,分別采用改良與傳統(tǒng)的石蠟組織免疫化學技術(shù)流程,檢測了目的蛋白,尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-type plasminogen activator,uPA)與其受體(urokinase-type plasminogen activator recepter,uPAR),在綿羊COCs中的表達情況,比較了兩種技術(shù)的免疫染色效果與染色流程差異。【結(jié)果】將所構(gòu)建的綿羊COCs仿組織結(jié)構(gòu)與正常綿羊卵泡組織,進行石蠟組織切片處理,經(jīng)切片、貼片與脫蠟等步驟,分別形成了散在分布于載玻片上的COCs薄片與包含卵泡的卵巢組織薄層(厚度5μm)。經(jīng)間接免疫染色處理后,結(jié)果顯示:①目的蛋白在兩種結(jié)構(gòu)COCs中的表達是一致的,即uPAR在綿羊卵丘與卵母細胞上都有表達,而uPA只存在于綿羊卵丘細胞中;②在綿羊COCs薄片結(jié)構(gòu)中,COCs整體形態(tài)完好,卵母細胞與外圍卵丘細胞層次清晰,蛋白定位清楚,染色效果良好;在卵巢薄層結(jié)構(gòu)中,綿羊卵泡內(nèi)壁顆粒細胞與COCs等形態(tài)結(jié)構(gòu)相對完整,卵母細胞蛋白定位清楚,但是卵丘細胞層次與蛋白表達較不清晰;③與綿羊卵巢組織石蠟切片技術(shù)相比較,綿羊COCs仿組織結(jié)構(gòu)石蠟切片技術(shù),在固定、脫水、透明、浸蠟以及脫蠟等步驟的處理時間都大大縮短,例如固定處理由24h縮短為2h;由逐級脫水的10h縮短為兩級脫水的1h;透明由30min縮短為10min;軟蠟與硬臘浸入由原來的6h縮短為1h;由逐級脫蠟的25min縮短為兩級脫蠟的10min等�！窘Y(jié)論】改進后的COCs仿組織石蠟切片染色技術(shù),顯示更優(yōu)質(zhì)的免疫定位與染色效果,不僅具有COCs獲得率高、卵母與卵丘細胞形態(tài)層次清晰等優(yōu)點,而且顯著縮短了操作時間,簡化了操作流程。該技術(shù)在保留COCs結(jié)構(gòu)完整的基礎(chǔ)上,有效檢測了目的蛋白在綿羊卵丘-卵母細胞復合體中的表達模式,對于探明綿羊卵泡發(fā)育與卵母細胞成熟機制,具有重要意義。
[Abstract]:[objective] during the development of ovine antral follicles, the multilayer cumulus cells tightly encircle the oocytes to form a special structure of cumulus-oocyte complex COCswhich exists in the follicular cavity. After follicle maturation, COC is excreted from the follicle, enters the fallopian tube and waits for fertilization. The existing techniques for identification of cumulus-oocyte complex proteins can either directly slice the ovarian tissues containing various follicles or separate COCs from the follicles for immunostaining at the level of intact cumulus-oocyte complexes. However, these two methods have significant defects in detecting the expression of target protein in COCs of sheep with antral follicles. The aim of this study was to improve the technique of paraffin tissue section. In order to meet the needs of sheep COCs protein identification. Firstly, the method of aspiration was used to obtain COCs from the ovine follicles, and a paraffin embedded method was used to construct a kind of "sheep cumulus-egg" which can be sliced. The mimic tissue structure of the mother cell complex. Then the specific structure and healthy ovaries of sheep were used to detect the target protein by using the modified and traditional paraffin immunohistochemical technique. Expression of urokinase-type plasminogen activator UPA and its receptor urokinase-type plasminogen activator receptor uPAR in sheep COCs. The immunostaining effect and the dyeing process of the two techniques were compared. [results] the constructed sheep COCs tissue was treated with paraffin tissue sections, and then treated with paraffin sections, patch and dewaxing, and the tissue structure of the constructed sheep follicles was compared with that of the normal sheep follicle tissues, and then treated with paraffin sections, patch and dewaxing. A thin layer of COCs and a thin layer of ovarian tissue containing follicles were formed (thickness 5 渭 m). The results of indirect immunostaining showed that the expression of the target protein was the same in COCs, that is, uPAR was expressed in both ovine cumulus and oocyte, but uPA was only present in sheep cumulus. (2) in the lamellar structure of sheep COCs, the overall morphology was intact, the layers of oocytes and peripheral cumulus cells were clear, the protein location was clear, and the staining effect was good. The morphology and structure of granulosa cells in the inner wall of sheep follicles and COCs were relatively complete, and the protein localization of oocytes was clear, but the level of cumulus cells and the expression of protein were not clear. Sheep COCs tissue structure paraffin section technology, in the process of fixation, dehydration, transparency, wax immersion and dewaxing, the processing time is greatly reduced. For example, fixation treatment shortened from 24 h to 2 h; from step by step dehydration from 10 h to 2 step dehydration; transparency from 30min to 10 min; soft wax and hard wax immersion from 6 h to 1 h; from step by step dewaxing 25min to two stage dewaxing 10min. [conclusion] the improved COCs imitating tissue paraffin section staining technique, The results showed that the improved immunolocalization and staining not only had the advantages of high COCs acquisition rate and clear morphology of oocytes and cumulus cells, but also significantly shortened the operation time and simplified the operation process. On the basis of preserving the structure of COCs, the expression pattern of the target protein in the cumulus oocyte complex of sheep was detected effectively, which is of great significance for the study of the mechanism of ovine follicular development and oocyte maturation.
【作者單位】： 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院;內(nèi)蒙古醫(yī)科大學心身醫(yī)學研究室;
【基金】：國家自然科學基金(31060165,31360283,31660701) 內(nèi)蒙古自然科學基金(2012MS0411)
【分類號】：S826

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本文編號：1944609