本文選題：圈養(yǎng)野生動物 + 偽狂犬病毒��； 參考：《甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：偽狂犬病是由偽狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PrV)感染引起的動物發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎為典型特征一種傳染病。偽狂犬病毒的宿主譜十分廣泛,包括豬、牛、犬、貓、鼠、貂、狐和兔等動物。近年來在我國偽狂犬病發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢。我們從臨床表現(xiàn)為重癥呼吸道癥狀的美洲獅、美洲虎、朝鮮豹、豹貓等多種圈養(yǎng)野生動物組織樣品中檢測到偽狂犬病毒,并針對性地開展了病毒分離、鑒定、動物回歸實(shí)驗(yàn)與初步調(diào)查研究。2012年2月~2012年3月,北京某動物園2只美洲獅、2只美洲虎、3只豹貓和1只朝鮮豹突然發(fā)病,臨床表現(xiàn)為精神萎頓、進(jìn)食量逐漸減少或不食、渴欲增強(qiáng),后發(fā)展為呼吸困難,經(jīng)常規(guī)治療無效死亡。采集肺、鼻甲骨、腸及內(nèi)容物、氣管、扁桃體、腎、肝、膀胱、脾、睪丸等組織樣品共40份。使用偽犬病毒特異性引物gBS/gBA、gDU/gDL進(jìn)行核酸擴(kuò)增和序列比對分析證明,上述動物的肺、脾、肝、腎組織樣品均呈偽狂犬病毒核酸陽性。依據(jù)國標(biāo)GB/T18641-2002的檢測方法,將組織樣品勻漿液接種于敏感動物兔,接種后的家兔在接種后12h表現(xiàn)出不安、畏人等偽狂犬病的典型臨床特征,至30h后抽搐死亡,符合偽狂犬病毒的敏感動物評價(jià)指標(biāo)。應(yīng)用Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒分離,分離株命名為BJ/Tiger/2012。進(jìn)一步細(xì)胞感染譜實(shí)驗(yàn)表明,該病毒分離株在F81上出現(xiàn)CPE的時(shí)間最短,引起細(xì)胞病變狀態(tài)為圓縮,集聚等;在MDCK細(xì)胞系上引起CPE,使細(xì)胞大量融合,出現(xiàn)拉網(wǎng)等;在Vero細(xì)胞系最初表現(xiàn)為拉網(wǎng)細(xì)胞融合、拉網(wǎng)等狀態(tài),但是隨著代次的增加病毒逐漸適應(yīng)細(xì)胞,Vero細(xì)胞病變由原來的大面積拉網(wǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)為細(xì)胞圓縮、多細(xì)胞融合等狀態(tài),并且出現(xiàn)病變時(shí)間縮短,由原來的72h縮短致48h。生物學(xué)與理化特性鑒定發(fā)現(xiàn),該毒株不凝集雞、貓、豚鼠、昆明鼠、Balb/C小鼠、東北虎的紅細(xì)胞,經(jīng)過紫外照射5min或56℃20min滅活病毒。提取BJ/Tiger/2012分離株的第4代細(xì)胞培養(yǎng)物總DNA,分別進(jìn)行g(shù)G、gE基因全長和gD保守區(qū)的擴(kuò)增。擴(kuò)增片段經(jīng)拼接后分別擴(kuò)增到與預(yù)期片段大小相近的片段。序列測定結(jié)果表明,去掉非編碼序列后gG全長為1500bp,gE全長1740bp,gD保守區(qū)序列為669bp。gG基因與Genbank中的收錄的偽狂犬病毒核酸序列同源性為98.9%~99.9%,與我國2013年提交序列登錄號為KC981239.1(北京)、KF711985.1(湖南)的核酸序列同源性為99.9%;gE基因與2013年我國提交至GenBank的16株病毒核酸序列同源性為97.8%~100%;gD保守區(qū)基因與2011年~2013年美國、韓國、中國(3個(gè)省)提交至Genbank的中10株病毒核酸序列同源性為96.6%~100%。進(jìn)化分析表明,該病毒與KF017275.1、KC415029.1、KF010501.1、KF130886.1、KF017333.1在同一進(jìn)化分枝,為偽狂病毒強(qiáng)毒株。為明確該病毒對貓科和犬科動物的致病性,分別進(jìn)行了BJ/Tiger/2012家貓和家犬的人工感染實(shí)驗(yàn)。通過滴鼻的方式接種的家貓,在接種后42h表現(xiàn)出神經(jīng)緊張、憂郁,隨后出現(xiàn)流涎,頭頸前挺,背最長肌僵直等臨床癥狀。在出現(xiàn)癥狀后8h突然倒地強(qiáng)直抽搐死亡。核酸擴(kuò)增檢測表明接種家貓肺、脾、腦、腸、腎的組織均為偽狂犬病毒核酸陽性。病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)肺泡腔巨噬細(xì)胞輕微增多,腎小管上皮細(xì)胞壞死、碎裂消失,骨骼肌肌纖維斷裂。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞,腎小管上皮細(xì)胞,腦橋組織細(xì)胞,腸系膜淋巴結(jié)邊緣區(qū)淋巴細(xì)胞和部分腸粘膜上皮細(xì)胞呈偽狂犬病毒抗原陽性。在家犬感染實(shí)驗(yàn)中,以滴鼻方式接種的家犬在接種后42h出現(xiàn)表現(xiàn)出精神沉郁、呼吸急促等臨床癥狀。第54h開始出現(xiàn)流涎,頭頸前挺,嘔吐物中有暗紅色泡沫狀,70h后死亡。剖檢見肺臟呈彌漫性出血和水腫,脾臟增厚、質(zhì)地較硬,腦積液增多。應(yīng)用PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)滴鼻接種的家犬肺、脾、腦、腸、腎等組織均為偽狂犬病毒核酸陽性,但胰、骨骼肌組織為陰性。皮下接種組家犬在接種36h后表現(xiàn)出焦躁,羞明、畏光和流淚等癥狀,隨后開始啃咬注射部位并表現(xiàn)出奇癢的臨床癥狀。皮下接種組的家犬在接種后54h后死亡,應(yīng)用PCR方法檢測,結(jié)果肺、脾、腦、腸、腎和接種部位均為偽狂犬病毒核酸陽性。為進(jìn)一步調(diào)查偽狂犬病毒對我國圈養(yǎng)野生貓科動物的感染情況,我們對實(shí)驗(yàn)室自2009年以來收集的219份野生動物、經(jīng)濟(jì)動物組織樣品和血清樣品分別進(jìn)行了偽狂犬病毒PCR檢測和gE-ELISA抗體檢測。從117份組織樣品中檢測到3份核酸陽性樣品,分別為北京某動物園于2013年和2015年的美洲虎、虎和1只虎的樣品。從102份血清樣品檢測到2份樣品為抗體陽性,分別為2012年北京某動物園狼血清樣品和2009年黑龍江某動物園虎血清樣品。本研究通過病毒分離鑒定、動物回歸試驗(yàn)和初步調(diào)查,證實(shí)了偽狂犬病毒對圈養(yǎng)野生貓科動物的致死性感染。系列研究結(jié)果提示應(yīng)在加強(qiáng)常規(guī)傳染病的防控同時(shí)密切關(guān)注在家養(yǎng)動物中廣泛流行的傳染病對野生動物的威脅。
[Abstract]:Pseudo - rabies virus is a typical characteristic of animal fever , itchiness , and encephalitis caused by the infection of pseudo - rabies virus ( PrV ) . In recent years , there have been a trend of virus isolation , identification , animal regression experiment and preliminary investigation . The results showed that the total length of gG was about 1740bp , and that of KF010501.1 , KF1306.1 and KF017333.1 were 93.9 % 锝，

本文編號：1944521