本文選題：抗繆勒氏管激素 + 卵母細胞成熟�。� 參考：《安徽農(nóng)業(yè)大學》2015年博士論文

【摘要】：卵泡募集、發(fā)育及排卵是影響人和家畜繁殖力的關(guān)鍵因素,是生殖生物學和動物繁殖學的重要研究領(lǐng)域。原始卵泡的生長啟動主要受卵巢自身自分泌、旁分泌因子調(diào)控,而抗繆勒氏管激素(AMH,anti-müllerian hormone)是目前已知唯一能抑制原始卵泡募集的內(nèi)分泌因子,被認為是卵泡發(fā)育的調(diào)控閥。然而,AMH在卵巢中的表達及調(diào)控機制還不清楚,極大地限制了AMH在畜牧生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。本文通過免疫熒光檢測、RNA干擾、實時熒光定量PCR、放射免疫測定、流式細胞術(shù)和數(shù)字芯片表達譜分析等手段,研究了AMH及其受體AMHR2在豬卵巢等組織的表達,探討了AMH對卵母細胞成熟及胚胎發(fā)育、顆粒細胞增殖和凋亡、類固醇產(chǎn)生、膜細胞類固醇產(chǎn)生、基因調(diào)控等方面的影響,分析了AMH在豬卵母細胞和顆粒細胞體外發(fā)育中的調(diào)控作用及其機制。結(jié)果如下:試驗一:AMH在豬卵巢及其它組織中的表達模式通過熒光定量PCR,發(fā)現(xiàn)豬AMH和AMHR2 mRNA均高表達于生殖器官睪丸和卵巢中,在其它組織器官中低表達或不表達。組織免疫熒光檢測結(jié)果表明,AMH在原始卵泡和初級卵泡顆粒細胞及卵母細胞中不表達,在腔前和有腔卵泡顆粒細胞中表達,高表達于卵丘顆粒細胞。熒光定量PCR結(jié)果顯示,當卵泡直徑從1~3mm增加到3~5mm時顆粒細胞中AMH mRNA表達顯著下降(P0.05)。當卵泡直徑從3~5mm到5mm時,顆粒細胞中AMHR2 mRNA表達量顯著升高(P0.05)。通過ELISA測定結(jié)果發(fā)現(xiàn),1~3mm卵泡中AMH濃度顯著高于3~5mm和5mm卵泡中AMH濃度(P0.05),在5mm的卵泡中,AMH濃度幾乎無法測出。結(jié)果提示,AMH在豬卵巢及其它組織中的表達模式和其它物種相似。試驗二:AMH對豬卵母細胞體外成熟的影響首先,以非限定性培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加不同濃度AMH,用于培養(yǎng)豬卵丘細胞-卵母細胞復(fù)合體(COCs,Cumulus-oocyte-complexes),42±2h后發(fā)現(xiàn),各處理組在卵母細胞成熟率、卵丘擴散指數(shù),孤雌激活后胚胎卵裂率、囊胚率和囊胚細胞數(shù)上均無顯著差異(P0.05)。其次,以含PG600的化學限定培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)液,添加不同濃度AMH并用于COCs體外培養(yǎng),42±2h后發(fā)現(xiàn),10ng?m L AMH可顯著提高卵母細胞成熟率(P0.05),但不影響其卵丘擴散指數(shù)和卵母細胞孤雌激活后的卵裂率、囊胚率和囊胚細胞數(shù)(P0.05);卵母細胞體外受精后,10ng?m L AMH可以顯著提高體外受精胚的卵裂率(P0.05),但對囊胚率和囊胚細胞數(shù)沒有影響(P0.05);卵母細胞成熟后,熒光定量PCR結(jié)果顯示,相對于對照組,10 ng?m L和100ng?m L的AMH添加組成熟卵母細胞中GDF9和BMP15 mRNA表達均無顯著變化(P0.05),且各組卵丘卵母細胞中CASPASE3和BAX mRNA均無顯著差異(P0.05),但10ng?m L和100ng?m L的AMH添加組BCL2 mRNA變動顯著高于對照組(P0.05)。結(jié)果表明,10 ng?m L AMH可促進卵母細胞核和胞質(zhì)成熟。試驗三:AMH在顆粒細胞中的調(diào)控作用體外培養(yǎng)期間,單獨添加AMH對顆粒細胞FSHR和CYP19A1 mRNA的表達及雌激素的產(chǎn)生無影響(P0.05),但FSH可以促進FSHR和CYP19A1mRNA的表達和雌激素的產(chǎn)生(P0.05)。FSH和AMH共同添加時,AMH可以顯著抑制FSH對FSHR和CYP19A1 mRNA表達和雌激素產(chǎn)生的促進作用。對顆粒細胞進行AMH si RNA干擾后,再以FSH處理培養(yǎng)的顆粒細胞,其FSHR和CYP19A1 mRNA表達和雌激素產(chǎn)生均顯著升高(P0.05),但與未干擾AMH且添加FSH組無顯著差異(P0.05)。結(jié)果說明,AMH具有抑制FSH促進豬顆粒細胞類固醇激素產(chǎn)生和相關(guān)基因表達的功能。試驗四:AMH對豬卵泡膜細胞類固醇激素產(chǎn)生的影響利用Procoll方法獲得高純度卵泡膜細胞,通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)卵泡膜細胞中有AMHR2 mRNA表達。LH處理卵泡膜細胞48h,可顯著提高卵泡膜細胞中類固醇合成的關(guān)鍵基因3β-HSD、CYP11A1、CYP17A1和LH受體LHCGR mRNA的表達和雄烯二酮、孕酮的產(chǎn)生(P0.05)。AMH處理膜細胞對3β-HSD、CYP11A1、CYP17A1、LHCGR、STAR和CYP17A1 mRNA的表達和雄烯二酮、孕酮的產(chǎn)生均無顯著影響(P0.05)。LH和AMH共同處理卵泡膜細胞時,顯著抑制LH誘導(dǎo)的3β-HSD、CYP11A1、、CYP17A1和LHCGR mRNA的高表達(P0.05),顯著降低雄烯二酮的產(chǎn)生(P0.05)。在AMHR2被si RNA干擾的卵泡膜細胞中,LH添加組與AMH/LH共同添加組中3β-HSD mRNA的表達無顯著差異(P0.05),表明AMH降低LH促進3β-HSD mRNA表達的協(xié)同作用消失。si AMHR2干擾后,LH顯著促進雄烯二酮和孕酮的產(chǎn)生(P0.05),而LH和AMH共同添加時,雄烯二酮的產(chǎn)生顯著高于對照組(P0.05),說明AMH對LH的促進的雄烯二酮分泌的抑制作用消失。結(jié)果提示,AMH在卵泡膜細胞中具有調(diào)控LH誘導(dǎo)類固醇產(chǎn)生的作用。試驗五:AMH處理豬體外培養(yǎng)腔前卵泡基因表達譜分析為探索褪黑素影響豬卵泡發(fā)生的分子機制,對AMH處理18.5 d的PFsOGCs進行數(shù)字芯片表達譜測序,通過差異基因表達分析,共篩選出159個上調(diào)基因和7個下調(diào)基因。qPCR驗證結(jié)果與測序結(jié)果一致,說明RNA-Seq數(shù)據(jù)真實可靠。Gene Ontology顯著性富集分析結(jié)果顯示,AMH添加組的差異基因顯著性富集于代謝通路、TGFβ家族、ECM-receptor等相關(guān)通路。本研究表明,AMH在豬卵巢中的表達模式與其他物種相似。10ng/m L AMH對卵母細胞核成熟和胞質(zhì)成熟有促進作用,提高卵母細胞成熟效率和體外受精的卵裂率。在豬顆粒細胞中,AMH可以抑制FSH誘導(dǎo)的芳香化酶和雌激素的產(chǎn)生。首次發(fā)現(xiàn)通過其受體,AMH可以抑制LH誘導(dǎo)的卵泡膜細胞雄烯二酮的產(chǎn)生,說明AMH在卵泡顆粒細胞和膜細胞均起到抑制類固醇產(chǎn)生的作用。AMH主要通過TGFβ通路、代謝通路和ECM-receptor通路調(diào)控基因。
[Abstract]:The expression of AMH and AMHR2 mRNA in the ovary and other tissues of porcine oocytes were studied by means of immunofluorescence assay , RNA interference , real - time fluorescence quantitative PCR , radioimmunoassay , flow cytometry and digital chip expression profiling . The results showed that AMH had no significant difference between the expression of FSHR and CYP19A1 mRNA and the production of estrogen ( P0.05 ) . The results showed that AMH could significantly increase the cleavage rate of FSHR and CYP19A1 mRNA and estrogen production ( P0.05 ) . The results showed that AMH could inhibit the production of testosterone induced by LH . The results showed that AMH could inhibit the production of testosterone and testosterone .
【學位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S828

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本文編號：1937259