發(fā)布時間：2018-05-18 04:28

  本文選題：牛傳染性鼻氣管炎病毒 + 熒光定量PCR��； 參考：《黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)是一種急性、熱性、接觸性傳染病，由牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)引起。臨床主要表現(xiàn)為高熱、呼吸困難、上呼吸道炎癥和母畜流產(chǎn)等。該病雖然致死率低，但對牛的育肥、產(chǎn)奶量和國際貿(mào)易有嚴(yán)重影響。建立靈敏、快速、可靠的檢測方法，凈化牛群，免疫接種疫苗，仍是預(yù)防和控制該病的重要措施。由于沒有合適的實驗動物模型，，傳統(tǒng)疫苗免疫后仍缺乏有效的免疫效力評價方法。因此，本研究在建立牛傳染性鼻氣管炎病毒的TaqMan-MGB熒光定量PCR方法的基礎(chǔ)上，對健康家兔及滅活苗免疫家兔的病毒侵染進(jìn)行了初步研究，對于疫苗免疫效力的評價及有效防控本病具有重要的現(xiàn)實意義。 本研究首先根據(jù)GenBank已公布的IBRV Bartha Nu/67株基因序列針對gB基因設(shè)計特異性引物和Taqman-MGB探針，建立了檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒的TaqMan-MGB熒光定量PCR方法。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)(R2)為0.998，103-108拷貝/μL內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。該方法靈敏度是常規(guī)PCR靈敏度的100倍，檢測下限為1.49×101拷貝/μL。特異性良好，對牛呼吸道其他病毒無交叉反應(yīng)。適用于臨床疑似樣品的快速定量檢測。 從17份疑似IBR癥狀的奶牛鼻拭子中，經(jīng)分離培養(yǎng)，PCR、間接免疫熒光試驗試驗、微量血清中和實驗與基因序列同源性分析鑒定，確定獲得一株IBRV，命名為IBRV DQ/14株。用TCID50為10-7.33/100μL的分離株鼻腔接種家兔，用鼻拭子采集第1-14d的鼻腔粘液，每隔7d分離血清。無菌采集第3、5、7、11和49d的剖殺兔組織臟器，熒光定量PCR、病理組織學(xué)和免疫組化檢測。結(jié)果表明，接毒后第2-7d家兔出現(xiàn)臨床癥狀并排毒至第7d，7-14d產(chǎn)生大量IgG抗體并維持?jǐn)?shù)周。病理組織學(xué)和免疫組化結(jié)果顯示，肺臟出現(xiàn)炎性反應(yīng)，鼻甲骨和肺臟上皮細(xì)胞均有病毒復(fù)制。研究表明該分離株對家兔有致病性。 用BEI滅活I(lǐng)BRV DQ/14分離株，以Montanide ISA206佐劑乳化制備滅活疫苗。分別接種斷奶仔兔和Balb/c小鼠，進(jìn)行安全性檢驗。間隔21d后兩次免疫日本大耳家兔，14d后進(jìn)行攻毒實驗。結(jié)果表明疫苗安全性良好。攻毒后，免疫組未出現(xiàn)臨床癥狀，免疫組化結(jié)果表明該疫苗阻止了分離株對呼吸道粘膜的侵染，免疫保護(hù)率為100%。 綜上所述，本研究成功建立了可用于臨床快速檢測IBRV的TaqMan-MGB熒光定量PCR方法；證明了IBRV DQ/14分離株對日本大耳家兔有較強(qiáng)的致病性，制備的滅活疫苗安全，可有效阻止病毒對呼吸系統(tǒng)的侵染。為IBRV的防制提供了有效措施。
[Abstract]:Infectious bovine rhinotrachetitis (IBR) is an acute, feverish, contact infectious disease caused by bovine infectious rhinotracheitis virus (IBRV). Clinical manifestations include high fever, dyspnea, upper respiratory inflammation and female abortion. Although the fatality rate is low, it has a serious effect on cattle fattening, milk production and international trade. It is still an important measure to prevent and control the disease by establishing a sensitive, rapid and reliable detection method, purifying cattle and vaccinating them. Due to the absence of suitable animal models, the traditional vaccine still lacks an effective method to evaluate the immune efficacy after immunization. Therefore, the infection of bovine infectious rhinotracheitis virus in healthy rabbits and inactivated rabbits was studied on the basis of the method of TaqMan-MGB fluorescence quantitative PCR for bovine infectious rhinotracheitis virus. It has important practical significance for the evaluation of vaccine immune effectiveness and the effective prevention and control of this disease. In this study, based on the sequence of IBRV Bartha Nu/67 strain published by GenBank, specific primers and Taqman-MGB probes were designed to detect bovine infectious rhinotracheitis virus by TaqMan-MGB fluorescence quantitative PCR. The results show that the correlation coefficient of the standard curve is 0.998103-108 copies / 渭 L with a good linear relationship. The sensitivity of this method is 100 times higher than that of conventional PCR, and the detection limit is 1.49 脳 101copy / 渭 L. It has good specificity and has no cross reaction to other viruses in bovine respiratory tract. It is suitable for rapid quantitative detection of suspected clinical samples. An IBRV strain was obtained from 17 nasal swabs of cows suspected to have IBR symptoms by isolation and culture, indirect immunofluorescence assay, microserum neutralization test and homology analysis of gene sequence. Rabbits were inoculated with nasal cavity with TCID50 of 10-7.33 / 100 渭 L, nasal swab was used to collect nasal mucus from day 1 to 14, and serum was isolated every 7 days. Tissue organs, fluorescence quantitative PCR, histopathology and immunohistochemistry were collected from rabbits at day 3, 5, 7, 11 and 49, respectively. The results showed that the rabbits developed clinical symptoms at 2-7 days and produced a large number of IgG antibodies at 7-14 days after detoxification for several weeks. Histopathological and immunohistochemical results showed that inflammatory reaction was found in the lungs and virus replication was found in both nasal turbinate bone and lung epithelial cells. The results showed that the isolate had pathogenicity to rabbits. BEI was used to inactivate IBRV DQ/14 isolate and Montanide ISA206 adjuvant emulsified to prepare inactivated vaccine. Weaning rabbits and Balb/c mice were inoculated for safety test. Japanese rabbits were immunized twice for 14 days after 21 days. The results showed that the vaccine was safe. The results of immunohistochemistry showed that the vaccine prevented the isolated strain from infecting the respiratory mucosa, and the immune protection rate was 100%. In conclusion, this study successfully established the TaqMan-MGB fluorescence quantitative PCR method which can be used for rapid clinical detection of IBRV, and proved that the isolated strain of IBRV DQ/14 has strong pathogenicity to Japanese large ear rabbits, and the inactivated vaccine prepared is safe. It can effectively prevent the infection of respiratory system. It provides effective measures for the prevention and control of IBRV.
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1904384