本文選題：PEDV + S基因��； 參考：《四川農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)引起的一種高度接觸性腸道傳染疾病。自2010年以來,PEDV感染已成為全球養(yǎng)豬業(yè)共同關(guān)注的問題。及時掌握PEDV流行毒株的分子特征,對指導(dǎo)該病具有重要意義。S基因編碼的S蛋白是PEDV的重要結(jié)構(gòu)蛋白,在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護(hù)等方面起關(guān)鍵作用,S基因較易發(fā)生變異。本研究對四川2014年P(guān)EDV流行毒株的S基因(包括S基因全序列和部分序列)進(jìn)行克隆、測序和分子特性分析,初步分析了流行株的S基因抗原性(包含COE區(qū)的抗原區(qū)域)。研究內(nèi)容如下：(1)四川PEDV流行株S基因的克隆與分子特征分析：以RT-PCR檢測了四川14個地區(qū)的17個豬場的102份發(fā)病仔豬腹瀉樣本,豬場PEDV陽性率達(dá)到100%(17/17),樣品PEDV陽性率為88.2%(99/102)。PEDV多為單獨(dú)感染。根據(jù)PEDV-CV777株序列(GenBank登錄號：AF353511)設(shè)計(jì)3對引物擴(kuò)增完整的S基因,選取2014年四川地區(qū)PEDV代表樣品擴(kuò)增了9株S基因全序列和18株S1區(qū)(起止位點(diǎn)：1-1389nt),采用RT-PCR擴(kuò)增S基因、克隆、測序和序列分析。結(jié)果表明：S基因S1片段變異較大,18株流行株S1片段全長為1398bp,編碼466個氨基酸,存在大量核苷酸的突變、插入及缺失,多以C→T、T→C、 G→T、T→G等突變形式存在。9株完整S基因中,8株全長為4161bp,編碼1386個氨基酸,1株為4125bp,編碼1374個氨基酸。PEDV四川流行株之間核苷酸序列同源性及氨基酸序列同源性均較高,與SC-L株及CV777疫苗株等的同源性均較低,與2013-2014年US株、Thailand、2014年韓國株等的同源性較高。S基因編碼的多肽鏈具有較好的親水性,分別含有1個跨膜區(qū)域及信號肽切割位點(diǎn),潛在的磷酸化位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn)與CV777差異較大。密碼子偏嗜性分析表明S基因?qū)幋a的T'rp, Met, His, Asp, Cys氨基酸具有一定的偏嗜性。S蛋白含有多個α螺旋區(qū)段、β折疊區(qū)段、β轉(zhuǎn)角區(qū)域及無規(guī)則卷曲區(qū)域。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明,本研究中的PEDV四川地區(qū)流行毒株均屬于同一群,18株四川流行株S1區(qū)與中國株CH8、YS、CHGD-01、GDMZ/2013、韓國株CNU-091222-01、美國株USA/Iowa/18984/2013、USA IA2、 USA/Indiana/17846/2013、USA/Kansas125/2014、US A/Texas 128/2014、最新韓國株Korea KUIDL-PED-2014-002及KUIDL-PED-2014-007、泰國株Thailand PPED0108、Thailand 1-55ST0412、Thailand 6-56ST0413、Thailand SBPED0211-2等親緣關(guān)系較近。COE區(qū)與S全基因與參考株的親緣關(guān)系與S1區(qū)相似,但COE區(qū)具有地區(qū)性差異,這提示四川境內(nèi)流行的毒株也在不斷進(jìn)化。此外,研究中所有四川地區(qū)PEDV流行毒株均與經(jīng)典毒株CV777、Brl/87,中國早期流行毒株LZC、SC-L、DX、韓國株Chinju99、DR13及日本株83p-5等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。(2)S蛋白抗原性的初步分析：本研究設(shè)計(jì)了包含COE區(qū)的部分S蛋白片段(命名為SD蛋白)的特異性引物SD-F、SD-R,用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增了PEDV四川樂山流行株及CV777疫苗株的892bp的抗原表位片段,并插入原核表達(dá)載體pET39b(+)中,分別構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET39b-SC-SD及pET39b-Vaccine-SD。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中,經(jīng)37℃,lmmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h, SDS-PAGE顯示目的基因片段得到表達(dá),目的蛋白分子量約為62kD,表達(dá)量較低。將包涵體切膠純化,以獲得的S蛋白抗原免疫家兔獲得兔抗多克隆抗體,通過瓊脂擴(kuò)散法測定抗體效價,流行株及疫苗株的效價分別為1：8、1：4,同時對純化的蛋白進(jìn)行Western blot檢測,表明獲得的抗體對原核表達(dá)的SD蛋白具有特異性反應(yīng)。
[Abstract]:Porcine Epidemic Diarrhea (PED) is a highly contagious intestinal infectious disease caused by the swine epidemic diarrhea virus (Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV). Since 2010, PEDV infection has become a common concern in the global pig raising industry. The S protein encoded by the.S gene is an important structural protein of PEDV, which plays a key role in inducing the body to neutralize antibodies and provide immune protection. The S gene is more susceptible to mutation. This study cloned the S gene of the PEDV epidemic strain of Sichuan in 2014, including the full and partial sequences of the S gene, and the sequence and molecule of the gene. The antigenicity of the S gene (including the antigen region of the COE region) was preliminarily analyzed. The contents of the study were as follows: (1) the cloning and molecular characterization of the S gene of Sichuan PEDV epidemic strain: 102 piglet diarrhoea samples were detected by RT-PCR in 17 pig farms in 14 regions of the City, and the positive rate of PEDV in the pig farm was 100% (17/17), and the sample PEDV The positive rate was 88.2% (99/102).PEDV as a single infection. According to the sequence of PEDV-CV777 strains (GenBank login number: AF353511), 3 pairs of primers were designed to amplify the complete S gene, and 9 S gene sequences and 18 S1 region (1-1389nt) were amplified by PEDV representative samples in 2014, and RT-PCR amplification of S genes, cloning, sequencing and sequence were used. The results showed that the S1 fragment of the S gene was highly variable. The total length of the 18 strains of the 18 strains was 1398bp, encoding 466 amino acids, and there were a large number of mutations, insertion and deletion of nucleotides, and there were more C to T, T to C, G to T, T to G, and the 8 strains were encoded 1386 amino acids, 1 strains were encoded 1374. The nucleotide sequence homology and amino acid sequence homology of the.PEDV Sichuan epidemic strains were high, and the homology of the SC-L strain and the CV777 vaccine strain was lower. The polypeptide chain with high homologous.S gene encoded by the 2013-2014 year US strain, Thailand, and 2014 Korean strain had better hydrophilicity, which contained 1 transmembrane regions, respectively. The potential phosphorylation sites and glycosylation sites are different from the CV777. The codon bias analysis shows that the S gene has a certain partial tropism of the encoded T'rp, Met, His, Asp, and Cys amino acids with a number of alpha helix segments, beta fold regions, beta corner regions and irregular curly regions. Genetic evolution points. The results show that all the epidemic strains in the PEDV Sichuan area belong to the same group, 18 strains of Sichuan epidemic strain S1 area and Chinese strain CH8, YS, CHGD-01, GDMZ/2013, Korean strain CNU-091222-01, American strain USA/Iowa/18984/2013, USA IA2, USA/Indiana/17846/2013, USA/. 002 and KUIDL-PED-2014-007, Thailand PPED0108, Thailand 1-55ST0412, Thailand 1-55ST0412, Thailand 6-56ST0413, Thailand SBPED0211-2 and so on, the relationship between the close.COE region and the S whole gene and the reference strain is similar to that of the S1 region, but the regional differences are regional, which suggests that the epidemic strains in Sichuan are also evolving. All the PEDV epidemic strains in Sichuan area were closely related to the classical strains CV777, Brl/87, Chinese early epidemic strains LZC, SC-L, DX, Korean strain Chinju99, DR13 and Japanese strain 83p-5. (2) preliminary analysis of the antigenicity of S protein: This study designed specific primers containing partial S protein fragments containing COE region. The epitope fragment of 892bp in Leshan Sichuan Leshan epidemic strain and CV777 vaccine strain was amplified by RT-PCR technique and inserted into the prokaryotic expression vector pET39b (+). The recombinant expression plasmid pET39b-SC-SD and pET39b-Vaccine-SD. were constructed to express the recombinant expression plasmid in BL21 (DE3), and the expression 4H was induced by 37 C and lmmol/L IPTG. AGE showed that the target gene fragment was expressed, the molecular weight of the target protein was about 62kD and the expression was low. The inclusion body was purified and the S protein antigen was purified to obtain the Rabbit anti polyclonal antibody and the antibody titer was measured by the agar diffusion method. The effective price of the epidemic strain and the vaccine strain was 1:8,1:4 respectively, and the purified protein was also carried out. Western blot showed that the antibody was specific for prokaryotic expression of SD protein.

【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李濤;王開功;程振濤;周碧君;文明;崔亞蘭;;豬圓環(huán)病毒2型三株貴州流行株全基因序列分析[J];生物技術(shù)通報;2014年03期

2 江國托,劉思國,步志高,祁賢,康麗娟,盧景良;雞傳染性支氣管炎病毒中國流行株免疫原基因的分子克隆與基因分型[J];中國免疫學(xué)雜志;1998年01期

3 賀志昊;孟慶玲;喬軍;劉昱成;楊海波;王國超;才學(xué)鵬;陳創(chuàng)夫;;牛乳頭瘤病毒基因2型流行株全基因組的克隆及序列分析[J];西北農(nóng)業(yè)學(xué)報;2013年11期

4 呂宗吉,李紅衛(wèi),涂長春,余興龍,吳健敏,李月紅,殷震;我國部分地區(qū)豬瘟病毒流行株的基因差異[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2000年04期

5 任濤,廖明,羅開健,曹偉勝,辛朝安;雞傳染性支氣管炎病毒中國地方流行株的分離與鑒定[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報;2002年04期

6 喬軍;夏咸柱;楊松濤;高玉偉;鞠會艷;胡桂學(xué);黃耕;;犬冠狀病毒流行株膜蛋白基因序列分析及其表達(dá)研究[J];Virologica Sinica;2006年05期

7 楊林,趙德明,王秀榮;豬瘟病毒流行株的分離鑒定[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2005年04期

8 方美玉,任瑞文,洪文艷,劉建偉,蔣廉華,田小東,林立輝;登革2型病毒廣東流行株結(jié)構(gòu)蛋白基因序列測定及分析[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2003年04期

9 耿慶華;王曉鈞;趙立平;呂曉玲;沈榮顯;相文華;;馬傳染性貧血病毒美洲流行株與我國弱毒疫苗株鑒別診斷方法的研究[J];Virologica Sinica;2006年01期

10 方英;毛君婷;史開志;王開功;周碧君;汪德生;文明;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒貴州流行株ORF5序列變異分析[J];山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報;2009年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 呂宗吉;涂長春;李紅衛(wèi);余興龍;吳健敏;李月紅;殷震;;中國豬瘟病毒流行株的基因多態(tài)性研究[A];新世紀(jì) 新機(jī)遇 新挑戰(zhàn)——知識創(chuàng)新和高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展（下冊）[C];2001年

2 王琴;王在時;趙耘;范學(xué)政;徐璐;宋立;朗洪武;丘惠深;寧宜寶;楊漢春;;我國豬瘟病毒流行株抗原性分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第六屆理事會第二次會議暨教學(xué)專業(yè)委員會第六屆代表大會論文集[C];2006年

3 王琴;王在時;寧宜寶;丘惠深;趙耘;張廣川;范學(xué)政;沈青春;秦玉明;涂長春;余興龍;呂宗杰;徐欣然;李紅衛(wèi);;我國部分豬瘟流行毒株病原學(xué)特性研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2004學(xué)術(shù)年會暨第五屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會論文集（下冊）[C];2004年

4 喬軍;夏咸柱;楊松濤;高玉偉;鞠會艷;胡桂學(xué);黃耕;;犬冠狀病毒流行株膜蛋白基因的分子進(jìn)化分析及其表達(dá)研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第六屆理事會第二次會議暨教學(xué)專業(yè)委員會第六屆代表大會論文集[C];2006年

5 蔡麗君;王均;許紅梅;常國輝;;2009年重慶地區(qū)腸道病毒71型流行株的分離鑒定及病毒基因特征[A];中華醫(yī)學(xué)會第十五次全國兒科學(xué)術(shù)大會論文匯編（上冊）[C];2010年

6 胡北俠;楊少華;任海松;許傳田;張琳;張秀美;;山東省雞傳染性支氣管炎病毒分離株抗原變異性分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會禽病學(xué)分會第十六次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2012年

7 楊小燕;劉建奎;魏春華;戴愛玲;李曉華;;閩西地區(qū)PRRSV流行株ORF3基因克隆與序列分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第八屆全國會員代表大會暨第十五次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2013年

8 何秀苗;韋平;熊忠賢;楊霖;戴書劍;劉紅全;;IBDV流行株的VP1部分序列的分析及比較[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會禽病學(xué)分會第十六次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2012年

9 李俊;徐紹建;時建立;吳家強(qiáng);溫建新;王金寶;;山東PRRSV流行株ORF5、ORF6、ORF7基因序列的遺傳演化和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會暨中國免疫學(xué)會獸醫(yī)免疫分會第七次研討會論文集[C];2008年

10 廖成水;程相朝;吳庭才;張春杰;李銀聚;郁川;王曉利;胡阿勇;;河南省雞源沙門氏菌新近流行株的分離鑒定及其耐藥性分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會禽病學(xué)分會第十五次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

相關(guān)重要報紙文章 前3條

1 鄭靈巧;福建病毒不是單一病毒[N];健康報;2006年

2 記者：趙雪 周清春 實(shí)習(xí)生：李維;圍追堵截傳染病[N];科技日報;2005年

3 江綜合;流感又現(xiàn)新毒株[N];新華日報;2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 李臻鵬;我國HIV-1流行株CRF07_BC和B'耐藥進(jìn)化研究[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2014年

2 劉惠莉;上海地區(qū)雞傳染性支氣管炎病毒流行株檢測分析及siRNA的干擾效應(yīng)[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 胡政香;綿羊肺炎支原體新疆塔城流行株的分離鑒定及油佐劑滅活苗免疫原性初步研究[D];石河子大學(xué);2015年

2 郭琦;人群血清中抗流感病毒中國流行株抗體水平研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

3 王鑫英;水中甲肝病毒濃縮方法初探及我國部分流行株遺傳特性分析[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2015年

4 沈震;上海地區(qū)諾如病毒分子流行病學(xué)調(diào)查及GII.4流行株進(jìn)化規(guī)律的初步研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

5 趙斐斐;1998-2009年浙江省流感主要流行株H3N2的全基因組特性研究[D];寧波大學(xué);2011年

6 李煥;2002～2010年浙江省急性出血性結(jié)膜炎暴發(fā)疫情病原CA24v的全基因組分析[D];寧波大學(xué);2014年

7 韋棟平;豬瘟病毒廣西流行株E_2基因擴(kuò)增與反應(yīng)條件的優(yōu)化研究[D];廣西大學(xué);2001年

8 王國超;牛病毒性腹瀉病毒新疆流行株的分離鑒定及E2基因遺傳變異研究[D];石河子大學(xué);2014年

9 侯文煥;河北省SMV流行株系動態(tài)分析、抗性資源挖掘及抗性遺傳分析[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

10 劉智勇;雞傳染性支氣管炎病毒河南部分流行株的分型研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

，

本文編號：1880571