本文選題：山羊 + CSN基因��； 參考：《甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)》2017年01期

【摘要】：【目的】使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)在山羊CSN2基因座內(nèi)含子7上篩選出高效的切割位點(diǎn).【方法】根據(jù)"20N+NGG"原則在CSN2內(nèi)含子7序列中設(shè)計(jì)了5個sgRNA靶向位點(diǎn).分別連接具有sgRNA到和Cas9表達(dá)框的PX330-P2A-eGFP載體上,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到實(shí)驗(yàn)室保存山羊胎兒成纖維細(xì)胞系中,PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)染陽性的細(xì)胞基因組CSN2內(nèi)含子7序列,連接到Pmd19-T載體中,測序比較不同的sgRNA介導(dǎo)切割產(chǎn)生的突變.【結(jié)果】使用5個sgRNA均可以在山羊CSN2基因內(nèi)含子7上造成有效切割,產(chǎn)生堿基刪除或者插入突變.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的5個sgRNA介導(dǎo)的CRISPR-Cas9系統(tǒng)效率均在30.7%以上,效率最高的2號位點(diǎn)(sgRNA2)介導(dǎo)的切割效率達(dá)到了61.5%.【結(jié)論】研究確定了CRISPR-Cas9系統(tǒng)在山羊CSN2基因內(nèi)含子7內(nèi)進(jìn)行高效切割的sgRNA,為之后在該基因位點(diǎn)進(jìn)行高效的非同源介導(dǎo)基因敲入奠定了基礎(chǔ).
[Abstract]:[objective] to screen efficient cleavage sites on intron 7 of goat CSN2 locus using CRISPR-Cas9 system. [methods] five sgRNA targeting sites were designed in CSN2 intron 7 sequence according to the "20N NGG" principle. SgRNA was ligated into the PX330-P2A-eGFP vector with sgRNA and Cas9 expression frame respectively. The positive genomic CSN2 intron 7 sequence was amplified by liposome transfection into goat fetal fibroblast cell line and ligated to Pmd19-T vector. [results] all 5 sgRNA could effectively cleavage the goat CSN2 gene intron 7, resulting in base deletion or insertion mutation. The efficiency of the five sgRNA mediated CRISPR-Cas9 systems was over 30.7%. The cleavage efficiency mediated by the most efficient site 2 was 61.5. [conclusion] the CRISPR-Cas9 system was identified as highly efficient cleavage in intron 7 of the goat CSN2 gene, which was used as a highly efficient non-homologous medium for the gene locus. [conclusion] the results indicate that the CRISPR-Cas9 system is highly effective in the cleavage of goat CSN2 gene intron 7. The conduction gene knockin lays the foundation.
【作者單位】： 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院;甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院;
【基金】：蘭州市科技局人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(2015-RC-7) 甘肅省高�？蒲袠I(yè)務(wù)基本費(fèi)(2011ZX08008-003)
【分類號】：Q78;S827

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本文編號：1880469