本文選題：BMP1 + 表達(dá)模式�。� 參考：《廣西大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：動物卵泡發(fā)生調(diào)控的分子機(jī)制是發(fā)育生物學(xué)研究的熱點(diǎn)問題。有研究表明,骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)家族廣泛參與動物卵泡發(fā)生調(diào)控的過程,其中BMP1基因與TGF-β家族的BMP2-7基因不同,BMP1是具有獨(dú)特蛋白結(jié)構(gòu)域的金屬蛋白酶,屬于蝦紅素家族。最新報道顯示,BMP1基因在綿羊卵泡發(fā)生過程中亦有表達(dá),但其在動物卵泡發(fā)生中的表達(dá)模式和功能仍待深入探索。本研究以單胎大家畜水牛、多胎家畜豬和多胎試驗(yàn)動物小鼠為模型,系統(tǒng)研究BMP1基因在卵泡發(fā)生各時期和早期胚胎發(fā)育時期表達(dá)模式,并通過卵泡顆粒細(xì)胞、體外成熟卵母細(xì)胞和活體卵巢試驗(yàn),探討其發(fā)揮調(diào)控卵泡發(fā)育的分子機(jī)制。取得如下結(jié)果：1.水牛BMP1基因克隆與生物信息分析以GenBank數(shù)據(jù)庫中牛的BMP1 (XM_002689771.1)為參考序列設(shè)計合成特異性擴(kuò)增引物,以水牛卵巢組織總RNA為模板,應(yīng)用RT-PCR成功擴(kuò)增獲得編碼水牛BMP1基因cDNA序列。測序結(jié)果表明：水牛BMP1基因的cDNA序列長3195 bp,包含完整的2967 bp的開放讀碼框,編碼989個氨基酸,蛋白分子量為111.5 kDa,等電點(diǎn)為7.08。序列相似性分析結(jié)果顯示水牛BMP1基因與牛、綿羊、豬、人和小鼠BMP1基因的核苷酸序列相似性分別為99%、98%、93%、91%和89%,氨基酸相似性分別為99%、97%、96%、95%和95%,進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹表明BMP1基因在動物進(jìn)化過程中具有高度的保守特性。蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示水牛BMP1基因具有顯著的HELGHVIGFWHE鋅離子結(jié)合域和保守的Met-turn SIMHY區(qū),含有一個前蛋白區(qū),一個鋅離子結(jié)合區(qū)、五個CMB和兩個EGF-Like功能區(qū),與其他物種BMP1基因的結(jié)構(gòu)域相同或相似,成功克隆了一種水牛物種的新型金屬蛋白酶。2.BMP1基因在水牛卵泡發(fā)生過程中的表達(dá)模式研究首先通過實(shí)時熒光定量PCR (QRT-PCR)和Western Blotting分析了BMP1基因在水牛不同組織器官中的表達(dá)模式及規(guī)律。結(jié)果顯示,BMP1基因在水牛胎兒時期不同組織中都有表達(dá)且差異顯著(P0.05),其中在心臟中表達(dá)最高,卵巢和睪丸次之。此外,Western Blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn),BMP1基因以不同剪切體的形式存在于水牛不同的組織當(dāng)中。分離不同直徑的水牛卵泡,QRT-PCR檢測結(jié)果顯示,BMP1基因在卵泡中的表達(dá)呈現(xiàn)隨著卵泡直徑的增大而逐漸升高的趨勢,在3-4.5 mm直徑卵泡中表達(dá)量最高,且不同直徑卵泡間BMP1基因的表達(dá)差異顯著(P0.05)。免疫組化分析結(jié)果顯示,BMP1基因從水牛胎兒時期的卵巢,以及到性成熟之后的水牛的卵巢中的不同發(fā)育時期的卵泡中都有不同程度的表達(dá),并主要表達(dá)于卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中。免疫熒光檢測結(jié)果顯示,BMP1基因特異性的定位于顆粒細(xì)胞中和卵母細(xì)胞的膜上。QRT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),BMP1基因在水牛成熟后COCs (卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體)和卵母細(xì)胞中表達(dá)量高于成熟前,且BMP1基因在COCs中的表達(dá)顯著高于裸卵(P0.05)。3.BMP1基因調(diào)控體外培養(yǎng)水牛顆粒細(xì)胞生長和卵泡發(fā)生的機(jī)制研究在水牛顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中添加不同濃度的BMP1重組蛋白和BMP1抗體,以研究BMP1基因?qū)︻w粒細(xì)胞增殖以及相關(guān)因子表達(dá)變化的影響。結(jié)果顯示：BMP1基因在體外培養(yǎng)水牛顆粒細(xì)胞中的表達(dá)隨著培養(yǎng)時間的延長而顯著增加(P0.05),在體外培養(yǎng)96h時達(dá)到最高。添加BMP1重組蛋白(25 ng/mL)顯著促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖(P0.05),提高顆粒細(xì)胞的S期細(xì)胞比例,并能夠抑制顆粒細(xì)胞的凋亡(P0.05)。BMP1重組蛋白(25 ng/mL)還可以顯著上調(diào)TGF-β信號通路中配體BMP2、BMP4、BMP6、BMP15、GDF9和TGF-β1-3等基因,受體如BMPR-IA、BMPR-IB、BMPR-Ⅱ和TGF-PR1-3等基因(P0.05),以及Smad蛋白如Smad2、Smad3、Smad4、Smad5等基因的表達(dá)(P0.05)。此外BMP1重組蛋白(25 ng/mL)可以顯著抑制三大細(xì)胞凋亡信號通路如線粒體通路如Cytochrome C、Apaf1,死亡受體通路如TNFα、TNFR1、Fas、FasL等,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路如Chop、Bax等促凋亡相關(guān)基因的表達(dá),以及抑制Caspase家族Caspase-3、 Caspase-8、Caspase-9和Caspase-12的表達(dá)(P0.05)。進(jìn)一步研究表明,BMP1重組蛋白(25 ng/mL)還顯著上調(diào)與卵泡選擇和優(yōu)勢化相關(guān)基因如VEGFR1、VEGFR2、PAPP-A、IGF-Ⅱ、IGF-ⅠR、IGF-ⅡR等基因的表達(dá)(P0.05),而添加BMP1抗體得到了相反的結(jié)果,并且隨著抗體濃度的增加(0～400 ng/mL),各基因的表達(dá)顯著下調(diào)或者顯著上調(diào)(P0.05),并顯示出劑量依賴效應(yīng)。4.BMP1基因在豬卵泡發(fā)生及早期胚胎發(fā)育中的表達(dá)模式和功能的初步研究首先采用QRT-PCR分析了BMP1基因在豬不同直徑卵泡中的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示,BMP1基因在1-2 mm直徑的卵泡中表達(dá)量最低,在4.5-6.5 mm直徑的卵泡中表達(dá)量最高,并隨著豬卵泡直徑的增大其表達(dá)量逐漸上升,且差異顯著(P0.05)。免疫組化分析結(jié)果顯示,BMP1基因在豬不同發(fā)育時期的卵泡中,從初級卵泡到格拉夫氏卵泡中都存在不同程度的表達(dá),并主要表達(dá)于卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中。免疫熒光結(jié)果顯示,BMP1基因在豬成熟前后卵母細(xì)胞和卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體中,以及早期孤雌胚胎的發(fā)育過程中都有表達(dá),并且特異性的表達(dá)于顆粒細(xì)胞膜中。QRT-PCR結(jié)果顯示,BMP1基因在豬成熟后COCs和卵母細(xì)胞中表達(dá)量顯著高于成熟前(P0.05),QRT-PCR和Western Blotting結(jié)果分析得知BMP1基因在豬早期孤雌胚胎中的表達(dá)呈現(xiàn)遞增的趨勢,2細(xì)胞時期表達(dá)最低,在8細(xì)胞時期達(dá)到最高,囊胚期顯著下降(P0.05)。通過在體外培養(yǎng)的豬卵母細(xì)胞培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的BMP1重組蛋白或者抗體,發(fā)現(xiàn)BMP1重組蛋白(25 ng/mL)可以顯著提高體外卵母細(xì)胞成熟效率,胚胎分裂率,囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)(P0.05)。而抗BMP1抗體添加組(0-400ng/mL)則顯示了相反的結(jié)果,且結(jié)果呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)。當(dāng)添加300 ng/mL和400 ng/mL的抗BMP1抗體時,體外培養(yǎng)的卵母細(xì)胞出現(xiàn)死亡。5.BMP1基因在小鼠卵泡發(fā)生過程中的表達(dá)模式和功能的研究應(yīng)用雌性昆明小鼠作為模式動物,研究BMP1基因在體內(nèi)卵泡發(fā)生中的表達(dá)模式及功能。QRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),BMP1基因在不同周齡小鼠的卵巢中都有表達(dá),且差異顯著(P0.05),并于6 W小鼠的卵巢中表達(dá)最高。通過免疫組化技術(shù)對BMP1基因在8d、3W、6W、11W和15W小鼠體內(nèi)卵巢進(jìn)行定位研究結(jié)果顯示,BMP1基因在’8d、3W、6W、11W和15W小鼠的卵巢中各卵泡發(fā)育階段中均有表達(dá),并特異性地表達(dá)于顆粒細(xì)胞,在黃體中不表達(dá)。隨后注射BMP1基因特異性抑制劑檢測卵泡發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)變化、卵巢形態(tài)變化、卵巢內(nèi)卵泡發(fā)育形態(tài),以及卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示,小鼠注射BMP1抑制劑后,卵巢內(nèi)卵泡的發(fā)育明顯減少,并停滯在初級卵泡階段。此外,卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞的凋亡顯著增多(P0.05)。QRT-PCR結(jié)果顯示,注射BMP1抑制劑后可以顯著抑制卵巢中TGF-β信號通路中配體BMP2、BMP3、BMP4、BMP6、BMP15、GDF9和TGF-β1-3等基因、受體如BMPR-IB、BMPR-Ⅱ和TGF-βR1-3等基因,以及Smad蛋白如Smad2、Smad3、Smad5和Smad8等基因的表達(dá)(P0.05),上調(diào)Follistatin、AMH、Smad6和Smad7的表達(dá)。此外三大細(xì)胞凋亡信號通路如線粒體通路如Cytochrome C、Apaf1,死亡受體通路如Fas和FasL等促凋亡相關(guān)基因的表達(dá)出現(xiàn)顯著上調(diào)(P0.05)的表達(dá)顯著升高(P0.05)。卵巢中與卵泡選擇和優(yōu)勢化相關(guān)基因如IGF-II、IGF-IR和IGF-IIR等基因的表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05)。結(jié)論：BMP1基因在水牛、豬和小鼠的卵泡發(fā)生過程中均有不同程度的表達(dá),BMP1基因主要通過調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖與凋亡,并通過影響TGF-P信號通路和細(xì)胞凋亡信號通路等相關(guān)因子的表達(dá)而調(diào)控動物的卵泡發(fā)育,并且主要影響動物卵泡的選擇和優(yōu)勢化過程。
[Abstract]:The molecular mechanism of BMP1 gene was cloned and analyzed . The molecular mechanism of BMP1 gene was 99 % , 98 % , 93 % , 91 % and 95 % , respectively . The expression of BMP1 gene was higher than that of naked eggs ( P0.05 ) . The results showed that the expression of BMP1 gene was higher than that of naked eggs ( P0.05 ) . The expression of BMP1 gene in the follicles of pigs with different developmental stages was significantly higher than that before maturation ( P0.05 ) . The results showed that the expression of BMP2 , BMP3 , BMP4 , BMP6 , BMP15 , GDF9 and TGF - 尾R1 - 3 and the expression of Smad protein , such as BMPR - IB , BMPR - 鈪，

本文編號：1818700