本文選題：PKR + 原核表達(dá)　； 參考：《甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：蛋白激酶R(PKR)可被病毒感染后誘導(dǎo)產(chǎn)生的干擾素和雙鏈RNA激活,是宿主天然免疫系統(tǒng)的重要抗病毒效應(yīng)因子。但是,許多病毒可以通過自身編碼的蛋白拮抗PKR的抗病毒作用,如流感病毒的NS1蛋白。為了給研究PKR與病毒蛋白的相互作用及其機(jī)制提供條件,本研究表達(dá)純化了PKR蛋白,并通過免疫動(dòng)物制備了PKR蛋白的多克隆抗體和單克隆抗體。試驗(yàn)1.蛋白激酶R的原核表達(dá)純化及多克隆抗體的制備利用RT-PCR方法擴(kuò)增人的PKR基因,定向克隆到原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中。經(jīng)序列測定分析后,將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)終濃度0.5mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)GST-PKR融合蛋白,表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析后確定融合蛋白獲得穩(wěn)定表達(dá)。隨后通過Glutathione-sepharose 4B親和層析純化系統(tǒng)對融合蛋白進(jìn)行初步純化,用離子交換層析及分子篩在AKTA Explorer上進(jìn)一步純化,得到高純度無標(biāo)簽的PKR蛋白。將獲得的PKR蛋白與等量的弗氏佐劑乳化后免疫新西蘭大白兔收集血清,制備多克隆抗體。通過斑點(diǎn)雜交方法檢測其效價(jià)達(dá)到1:50000以上,并經(jīng)Western blot和間接免疫熒光(IFA)試驗(yàn)分析顯示,多克隆抗體對PKR蛋白具有高度特異性。試驗(yàn)2.蛋白激酶R單克隆抗體的制備利用前面試驗(yàn)表達(dá)純化的PKR蛋白為免疫原,免疫8周齡左右的SPF雌性BALB/C小鼠,進(jìn)行4次免疫,第4次免疫后3天無菌條件下取小鼠脾細(xì)胞與處于對數(shù)生長期的SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。通過間接ELIAE方法鑒定陽性雜交瘤細(xì)胞,之后利用有限稀釋法對效價(jià)高的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行4次亞克隆,最終獲得持續(xù)分泌抗PKR的單克隆雜交瘤細(xì)胞3株,分別命名為2E8、4A7、5A4,檢測培養(yǎng)基上清中抗體滴度分別為1:3200、1:3200、1:6400,取抗體滴度最高的5A4雜交瘤細(xì)胞腹腔注射10周齡左右SPF的BALB/C小鼠,7天后收集腹水,測定腹水效價(jià)為1:512000。3株雜交瘤細(xì)胞抗體亞型鑒定均為IgG1型。間接免疫熒光(IFA)試驗(yàn)分析顯示,單克隆抗體對PKR蛋白具有高度特異性。經(jīng)間接ELISA檢測,獲得的3株雜交瘤細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)多代和凍存復(fù)蘇后細(xì)胞培養(yǎng)基上清中抗體的滴度和OD值基本一致,抗體能持續(xù)的分泌,表明PKR單克隆抗體制備成功。
[Abstract]:Protein kinase (PKR), which can be activated by interferon and double-stranded RNA induced by virus infection, is an important antiviral effector of host innate immune system. However, many viruses can antagonize the antiviral effects of PKR through their own encoded proteins, such as the NS1 protein of influenza viruses. In order to study the interaction between PKR and virus protein and its mechanism, the PKR protein was expressed and purified, and the polyclonal antibody and monoclonal antibody of PKR protein were prepared by immunizing animals. Experiment 1. Prokaryotic expression and purification of protein kinase R and preparation of polyclonal antibody human PKR gene was amplified by RT-PCR and cloned into prokaryotic expression vector pGEX-6P-1. After sequence analysis, the positive recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) competent cells, and the GST-PKR fusion protein was induced by the final concentration of 0.5mmol/L IPTG. The expression product was confirmed by SDS-PAGE analysis to obtain stable expression of the fusion protein. The fusion protein was purified by Glutathione-sepharose 4B affinity chromatography system, and then purified on AKTA Explorer by ion exchange chromatography and molecular sieve. The obtained PKR protein was emulsified with Freund's adjuvant to immunize New Zealand white rabbits to prepare polyclonal antibodies. The titer of the polyclonal antibody was over 1: 50000 by dot blot. The results of Western blot and indirect immunofluorescence assay showed that the polyclonal antibody was highly specific to PKR protein. Experiment 2. Preparation of Monoclonal Antibody against protein Kinase R Immunization of SPF female BALB/C mice at about 8 weeks of age by immunizing the purified PKR protein expressed in the previous test for 4 times. Three days after the fourth immunization, murine spleen cells were harvested and fused with myeloma cells of SP2/0 mice in logarithmic phase. The positive hybridoma cells were identified by indirect ELIAE method, and then subcloned the hybridoma cells with high titer by limited dilution method for 4 times. Finally, 3 monoclonal hybridoma cell lines secreting anti-PKR were obtained. The antibody titers in the supernatant of the culture medium were 1: 3 200 and 1: 6400, respectively. The 5A4 hybridoma cells with the highest antibody titers were injected intraperitoneally into the BALB/C mice of about 10 weeks old to collect ascites after 7 days. The titer of ascites was 1: 512000.3 strain hybridoma cell antibody subtypes were identified as IgG1 type. Indirect immunofluorescence assay showed that monoclonal antibody was highly specific to PKR protein. The antibody titers and OD values in the supernatant of the three hybridoma cells cultured in vitro and resuscitated by cryopreservation were basically the same, and the antibody could be secreted continuously, which indicated that the monoclonal antibody against PKR was successfully prepared.
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.4

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本文編號：1818582