本文選題：J亞群禽白血病病毒 + H9N2亞型禽流感病毒��； 參考：《山東農業(yè)大學》2015年碩士論文

【摘要】：J亞群禽白血病病毒(ALV-J)和H9N2亞型禽流感病毒(H9N2 AIV)是兩種嚴重危害世界各國包括我國的養(yǎng)禽業(yè),并對其造成巨大經濟損失的禽類病毒。目前這兩種病毒的傳統(tǒng)檢測方法大都存在處理周期長、成本高,有時檢測結果易出現(xiàn)假陽性等缺點。另外,轉基因作物的大量種植造成了生態(tài)系統(tǒng)方面的擔憂,轉基因食品對人類的健康是否具有危害也存在較大爭議。而當前現(xiàn)有的轉基因蛋白的檢測技術存在著操作復雜、耗時較長、成本高、重現(xiàn)性和準確性差的缺點。因此,本文將采用具有免標記樣品、實時在線監(jiān)測、靈敏快速檢測的突出特點的表面等離子體共振(SPR)生物傳感器檢測這兩種禽類病毒和轉基因蛋白Cry1Ab。同時為了提高構建的SPR生物傳感器的靈敏度,使檢測結果更準確,Au/Ag復合納米粒子和三角Ag納米片作為增敏材料被引入傳感器中。本文包括以下三部分實驗內容。(1)實驗構建了兩種SPR生物傳感器——傳統(tǒng)模式生物傳感器和Au/Ag復合納米粒子增敏的生物傳感器用于檢測ALV-J。前者借助Au-S鍵使3-巰基丙酸(MPA)在SPR裸金膜芯片上形成一層密集的自組裝單分子層,通過氨基與MPA中被活化劑活化后的羧基結合使蛋白A修飾到芯片上,接著芯片被乙醇胺滅活后,ALV-J抗體的非抗原結合位點與蛋白A結合使抗體修飾到芯片上,最后實現(xiàn)了對ALV-J抗原的檢測;后者借助Au-S鍵使1,6-己二硫醇(HDT)一端在裸芯片上形成一層密集的自組裝單分子層,另一端借助Au-S鍵、Ag-S鍵使Au/Ag復合納米粒子修飾到芯片上,接下來傳感器修飾各種物質與檢測的方法同前者。結果兩種傳感器均能成功檢測ALV-J抗原,檢測限分別是1054 TCID50·mL 1和659 TCID50·mL 1,說明將Au/Ag復合納米粒子引入SPR生物傳感器中可有效提高傳感器的靈敏度。而且進行的對比實驗展現(xiàn)了制備的傳感器具有良好的特異性。(2)實驗構建了一種新型的SPR生物傳感器用于檢測H9N2 AIV。首先借助HDT將三角Ag納米片修飾到芯片上,然后依次在芯片上修飾MPA、蛋白A和兔抗H9N2單克隆抗體,并最終實現(xiàn)對H9N2 AIV及裂解AIV的檢測。結果傳感器能順利檢測完整的H9N2 AIV,最低檢測濃度為103 ELD50·mL 1。裂解病毒的濃度在50~103 ELD50·mL 1范圍內與SPR信號成線性關系,檢測限為28 ELD50·mL 1(S/N=3)。另外,此SPR生物傳感器還展現(xiàn)了良好的檢測特異性。(3)實驗構建了兩種SPR生物傳感器(傳感器1和傳感器2)用于檢測轉基因蛋白Cry1Ab。在傳感器2的芯片上依次修飾HDT、Au/Ag復合納米粒子、MPA、蛋白A和鼠抗Cry1Ab單克隆抗體,從而實現(xiàn)對Cry1Ab蛋白的檢測。傳感器1與傳感器2的構建過程相比,不同點在于沒有先固定蛋白A而直接固定抗體。結果這兩種傳感器分別在Cry1Ab蛋白的濃度為10~500 ng·mL 1和8~1000 ng·mL 1時有良好的線性響應,檢測限分別為5.0 ng·mL 1和4.8 ng·mL 1(S/N=3)。同時兩種生物傳感器均具有較高的特異性和較好的重現(xiàn)性。
[Abstract]:Subgroup J Avian Leukemia virus (ALV-JV) and H9N2 subtype Avian Influenza virus (H9N2 AIVA) are two kinds of avian viruses which seriously harm poultry industry in the world, including our country, and cause great economic losses to them. At present, most of the traditional detection methods of these two viruses have the disadvantages of long processing cycle, high cost and false positive results. In addition, the large number of genetically modified crops has caused ecosystem concerns, and whether GM food is harmful to human health is controversial. However, the existing detection techniques for transgenic proteins have the disadvantages of complex operation, long time consuming, high cost, poor reproducibility and accuracy. Therefore, a surface plasmon resonance (SPR) biosensor with the characteristics of non-labeled samples, real-time on-line monitoring and sensitive and rapid detection will be used to detect the two avian viruses and the transgenic protein Cry1Ab. At the same time, in order to improve the sensitivity of the constructed SPR biosensor and make the detection results more accurate, the Au/ Ag composite nanoparticles and triangular Ag nanoparticles were introduced into the sensor as sensitizing materials. In this paper, two kinds of SPR biosensors, traditional biosensors and Au/Ag composite nanoparticles biosensors were constructed to detect ALV-Js. The former formed a dense monolayer of self-assembly on SPR bare gold film chip by Au-S bond. Protein A was modified onto the chip by the binding of amino group to carboxyl group activated by activator in MPA. Then the chip was inactivated by ethanolamine and the non-antigen binding site of ALV-J antibody combined with protein A to modify the antibody onto the chip. Finally, the detection of ALV-J antigen was realized. The latter can form a dense self-assembled monolayer on the bare chip at one end and the Au/Ag composite nanoparticles on the chip by the Ag-S bond of the Au-S bond at one end of the chip by the aid of the Au-S bond, and the latter can form a dense self-assembled monolayer layer on the bare chip at one end and the other end on the other end by using the Ag-S bond of the Au-S bond. The sensor then modifies various substances and detects them in the same way as the former. Results the detection limits of ALV-J antigen were 1054 TCID50 / mL ~ (-1) and 659 TCID50 / mL ~ (-1), respectively, which indicated that the sensitivity of SPR biosensor could be improved effectively by introducing Au/Ag nanoparticles into SPR biosensor. Moreover, a new SPR biosensor was constructed for the detection of H9N2 SPR biosensor, which showed that the prepared biosensor has a good specificity. Firstly, the triangular Ag nanoparticles were modified onto the chip by HDT, then the MPA, protein A and rabbit anti- monoclonal antibody were modified on the chip in turn, and the detection of H9N2 AIV and AIV was finally realized. Results the sensor was able to detect the complete H9N2 AIV successfully, and the lowest detection concentration was 103 ELD50 / mL ~ (-1). The concentration of lytic virus was linearly correlated with SPR signal in the range of 50 ELD50 / 103 ELD50 / mL, and the detection limit was 28 ELD50 / mL ~ (-1) S / N ~ (-1) N ~ (3 +). In addition, two kinds of SPR biosensors (sensor 1 and sensor 2) were constructed to detect the transgenic protein Cry1Ab. The Cry1Ab protein was detected on the chip of sensor 2 by modifying MPA, protein A and mouse anti Cry1Ab monoclonal antibody in turn. The difference between sensor 1 and sensor 2 is that the antibody is not fixed first but directly. Results the two kinds of sensors showed good linear response at the concentration of 10 ~ 500ng / mL ~ (-1) of Cry1Ab protein and a concentration of 81000 ng / mL ~ (-1) of Cry1Ab protein, respectively. The detection limits were 5.0 ng / mL ~ (-1) and 4.8 ng / mL ~ (-1) ~ (-1) S / N ~ (-1) respectively. At the same time, the two biosensors have high specificity and good reproducibility.
【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65;TP212.3

【共引文獻】

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本文編號：1814088