本文選題：抗繆勒管激素 + 豬��； 參考：《安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：抗繆勒氏管激素(anti-müllerian hormone,AMH)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor,TGF-β)超家族成員之一,由生長(zhǎng)卵泡中的顆粒細(xì)胞分泌,能夠抑制原始卵泡的募集和降低生長(zhǎng)卵泡對(duì)促卵泡素的敏感性,但其作用機(jī)制尚不清楚。豬是醫(yī)學(xué)試驗(yàn)上理想的動(dòng)物模型,為了深入探討AMH在對(duì)豬卵泡膜細(xì)胞在類固醇合成上的作用,開(kāi)展了如下實(shí)驗(yàn):試驗(yàn)一:AMH在豬上的表達(dá)模式本試驗(yàn)主要采用RT-qPCR技術(shù),分析了AMH及AMHR在豬不同組織器官上以及在不同卵泡直徑上的表達(dá)規(guī)律;利用ELISA技術(shù),分析了在不同直徑卵泡液中AMH的表達(dá)規(guī)律。試驗(yàn)結(jié)果表明:AMH及AMHR2在豬睪丸和卵巢中高表達(dá),而在其它組織中不表達(dá)或表達(dá)量極低。顆粒細(xì)胞中AMH mRNA水平和卵泡中蛋白水平均呈現(xiàn)隨著卵泡直徑的增大,AMH的表達(dá)量逐漸降低;在大卵泡(5mm)顆粒細(xì)胞中,AMHR2表達(dá)量最高(P0.05),而小卵泡及中卵泡(直徑1-5mm)的顆粒細(xì)胞中AMHR2的表達(dá)量最低,且無(wú)明顯差異(P0.05)。這說(shuō)明,AMH及AMHR2的表達(dá)量與卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育階段有關(guān)。試驗(yàn)二:豬卵巢卵泡膜細(xì)胞的分離純化和培養(yǎng)采用三種方法進(jìn)行了豬卵泡膜細(xì)胞的優(yōu)化,方法A:注射針頭刮去顆粒細(xì)胞層,方法B:手術(shù)剪碎膜細(xì)胞層。A和B法均用IV型膠原酶消化后percoll密度梯度離心獲取44%和35%中間層為膜細(xì)胞,C法直接將膜細(xì)胞層用IV型膠原酶消化后采用兩次percoll梯度離心獲取卵泡膜細(xì)胞。利用波形蛋白、角蛋白、因子Ⅷ三種蛋白的抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色鑒定和流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞純度。結(jié)果表明:方法A獲得的膜細(xì)胞存活率及純度均顯著高于方法B和C(92.00%vs.80.33%,85.00%;95.77%vs.87.87%,90.87%)(P0.05);方法B獲得的細(xì)胞數(shù)顯著高于方法A和C(1.06×107vs.0.74×107,0.86×107)(P0.05),但耗時(shí)顯著低于方法A和C(236.67min vs.260.00min,268.33min)(P0.05)。結(jié)論:方法A可獲得較高膜細(xì)胞純度和細(xì)胞活力,本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究膜細(xì)胞的功能提供了基礎(chǔ)。試驗(yàn)三:AMH對(duì)卵泡膜細(xì)胞上類固醇激素合成酶的影響及機(jī)制研究FSH和AMH單獨(dú)或是共同添加于卵泡膜細(xì)胞中48 h后,通過(guò)Real-time qPCR發(fā)現(xiàn):在豬卵泡膜細(xì)胞中,FSH和AMH無(wú)論是單獨(dú)作用還是聯(lián)合作用,對(duì)LHCGR、STAR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD的表達(dá)均無(wú)顯著影響(P0.05),但FSH或AMH單獨(dú)作用能夠顯著提高STAR mRNA的表達(dá)(P0.05),FSH和AMH共同作用對(duì)STAR mRNA的表達(dá)水平無(wú)顯著影響(P0.05)。這表明,FSH和AMH在促進(jìn)類固醇合成起始過(guò)程中可能存在協(xié)同作用。LH和AMH單獨(dú)或共同添加于卵泡膜細(xì)胞中48 h后,通過(guò)Real-time qPCR發(fā)現(xiàn):在豬卵泡膜細(xì)胞中,LH單獨(dú)作用能夠誘導(dǎo)LHCGR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA表達(dá)水平上調(diào)(P0.05);AMH單獨(dú)作用對(duì)LHCGR、STAR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著影響(P0.05);LH和AMH聯(lián)合作用時(shí),LHCGR、CYP17A1、3β-HSD mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組及AMH單獨(dú)作用組均無(wú)顯著差異(P0.05),但顯著低于LH單獨(dú)作用組的水平(P0.05),而對(duì)STAR、CYP11A1 mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著影響(P0.05)。Forskolin和AMH單獨(dú)或共同添加于卵泡膜細(xì)胞中48h后,通過(guò)Real-time qPCR發(fā)現(xiàn),在豬卵泡膜細(xì)胞中,Forskolin能夠顯著上調(diào)LHCGR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA的水平(P0.05);Forskolin和AMH共同作用也可上調(diào)LHCGR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA表達(dá)水平,且與Forskolin單獨(dú)作用無(wú)顯著差異。這表明,在豬卵泡膜細(xì)胞上,AMH并不是以cAMP作為通路調(diào)控的。通過(guò)普通PCR發(fā)現(xiàn),豬卵泡膜細(xì)胞上存在AMHR2。在AMHR2被siRNA干擾的膜細(xì)胞中添加LH和AMH,通過(guò)Real-time qPCR發(fā)現(xiàn):LH能夠上調(diào)LHCGR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA水平(P0.05);但AMH對(duì)LHCGR、STAR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD m RNA水平無(wú)顯著影響(P0.05);LH和AMH共同作用時(shí),LHCGR、CYP11A1和CYP17A1 mRNA表達(dá)水平均與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P0.05),而3β-HSD mNRA表達(dá)水平顯著上調(diào)(P0.05)。這表明,AMH在卵泡膜細(xì)胞上是通過(guò)3β-HSD進(jìn)而調(diào)控LH誘導(dǎo)的類固醇合成。綜上所述,本研究表明,AMH在豬上的表達(dá)模式與其它物種的相似,AMH及AMHR2的表達(dá)量與卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育階段有關(guān)。首次發(fā)現(xiàn),豬的卵泡膜細(xì)胞上表達(dá)AMHR2,并且AMH通過(guò)與AMHR2的結(jié)合能夠調(diào)控3β-HSD的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控LH誘導(dǎo)的類固醇合成。
[Abstract]:The results showed that AMH and AMHR2 were highly expressed in porcine testis and ovary . The results showed that AMH and AMHR2 were highly expressed in porcine testis and ovary . The results showed that AMH and AMHR2 were highly expressed in porcine testis and ovary . The results showed that AMH and AMHR2 were highly expressed in different tissues of pigs . The results showed that AMH and AMHR2 were significantly higher than those of methods B and C ( 92.00 % vs . 80.33 % , 85.00 % ; 95.77 % vs . 87.87 % , 90.87 % ) ( P0.05 ) . There was no significant difference between the expression levels of LH and AMH ( P0.05 ) . The effects of LH and AMH alone or together on the levels of the mRNA expression in LHCGR , STAR , CYP11A1 , CYP17A1 and 3尾 - HSD were not significantly affected ( P0.05 ) . The results showed that AMH could up - regulate the levels of LHCGR , CYP11A1 , CYP17A1 and 3尾 - HSD mRNA ( P0.05 ) , but AMH could regulate the expression of LHCGR , STAR , CYP11A1 , CYP17A1 and 3尾 - HSD mRNA ( P0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S828

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本文編號(hào)：1778127