本文選題：高爾基體α-甘露糖苷酶II　切入點(diǎn)：山羊　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：高爾基體α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgiα-mannosidase,GMⅡ)是N-糖基化過(guò)程的一個(gè)關(guān)鍵酶。研究表明,GMⅡ被抑制后腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移能力明顯降低,GMⅡ抑制劑苦馬豆素(swainsonine,SW)已被證實(shí)具有抗腫瘤效果,但SW可同時(shí)抑制溶酶體α-甘露糖苷酶導(dǎo)致溶酶體貯積癥。因此,對(duì)GMⅡ進(jìn)行特異性抑制成為抗腫瘤治療的重要途徑。研究GMⅡ結(jié)構(gòu)可以充分理解其催化和抑制機(jī)制,為GMⅡ的特異性抑制提供分子和理論基礎(chǔ)。目前,僅報(bào)道了果蠅GMⅡ的晶體結(jié)構(gòu),GMⅡ的基因序列僅從果蠅、鼠類(lèi)、人、擬南芥屬等種屬中提取,其蛋白表達(dá)也局限于在細(xì)胞中進(jìn)行。對(duì)哺乳動(dòng)物GMⅡ的深入研究還尚未進(jìn)行,這大大縮小了GMⅡ的抗腫瘤研究范圍。本試驗(yàn),以山羊?yàn)檠芯繉?duì)象,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)獲得山羊GMⅡ(chGMⅡ)的cDNA序列,利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)該蛋白,通過(guò)同源建模和分子對(duì)接等生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)其空間結(jié)構(gòu)和活性位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè),為進(jìn)一步對(duì)哺乳動(dòng)物的抗腫瘤試驗(yàn)研究打下分子基礎(chǔ)。試驗(yàn)結(jié)果如下:1.從山羊肝臟組織中提取出總量RNA,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)擴(kuò)增出全長(zhǎng)為3552 bp的chGMⅡ cDNA序列,并將此序列提交至GeneBank(KF717587)。對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),該序列包括一個(gè)可編碼1144個(gè)氨基酸的完整CDS區(qū),蛋白分子量和理論等電點(diǎn)(pI)分別為130.589 kD和8.04,無(wú)信號(hào)肽序列,含一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,其二級(jí)結(jié)構(gòu)包括23.5%的α-螺旋、22.1%的β-折疊和54.4%的Loop結(jié)構(gòu)。2.利用熒光定量PCR技術(shù),獲得chGMⅡ在心、肝、脾、肺、腎、卵巢、小腸7種不同組織中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明,chGMⅡ在七種組織中均有表達(dá),但在脾臟的表達(dá)量最高,肝臟、卵巢、肺臟、小腸次之,心臟和腎臟中表達(dá)量最低。3.利用SWISS-MODEL同源建模工具建立chGMⅡ的空間三維結(jié)構(gòu),經(jīng)Procheck軟件對(duì)其質(zhì)量評(píng)估發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)的大多氨基酸均處于允許區(qū)域,建模質(zhì)量良好。利用該結(jié)構(gòu)分別與其特異性底物GnMan5Gn2和抑制劑SW進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果發(fā)現(xiàn),由Zn原子、Asp178,His176,Asp290和His570殘基構(gòu)成的錐形立方體是chGMⅡ的活性中心。4.成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-chGMⅡ并將其導(dǎo)入畢赤酵母X-33進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá),通過(guò)SDS-PAGE和Western blotting對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)成功表達(dá)出分子量為130 kDa的chGMⅡ,且胞內(nèi)表達(dá)量高于胞外,堿性條件下更適合其表達(dá),且在pH8條件下表達(dá)產(chǎn)物最多。5.對(duì)純化的chGMⅡ進(jìn)行活性檢測(cè),測(cè)得其酶活力為149.38 U,最適溫度42℃,pH5.4,Fe2+、Zn2+、Ca2+和Mn2+可促進(jìn)其活性,而Cu2+、Co2+、EDTA可抑制其活性。
[Abstract]:Golgi 偽 -mannosidase 鈪，

本文編號(hào)：1696283