本文選題：犬瘟熱病毒　切入點(diǎn)：基質(zhì)膜蛋白　出處：《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：近年來(lái),病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)作為一種同時(shí)兼顧安全性和免疫原性的疫苗形式逐漸成為病毒疫苗研究熱點(diǎn)和未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)之一。研究表明副黏病毒基質(zhì)蛋白M是VLPs形成和出芽的主要驅(qū)動(dòng)力,與表面糖蛋白(F、H)共表達(dá)后可以形成VLPs且大小與真實(shí)病毒粒子相似,同時(shí)可保證有足夠的保護(hù)性抗原。因此,具有天然構(gòu)象的M、F和H蛋白的表達(dá)是犬瘟熱病毒VLPs組裝的前提條件。本研究基于桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分別構(gòu)建了表達(dá)犬瘟熱病毒M、F和H蛋白的重組桿狀病毒,并通過(guò)原核表達(dá)蛋白制備鼠抗M、F、H蛋白及兔抗H蛋白多克隆抗體,對(duì)各重組桿狀病毒在昆蟲(chóng)細(xì)胞中目的蛋白的表達(dá)分別進(jìn)行了鑒定,為包裝犬瘟熱病毒VLPs奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容如下:1、犬瘟熱病毒M、F和H蛋白的原核表達(dá)及其多克隆抗體的制備1、犬瘟熱病毒M、F和H蛋白的原核表達(dá)及其多克隆抗體的制備以小熊貓?jiān)慈翢岵《抉Z化致弱株LP為研究對(duì)象,分別針對(duì)其M、F和H蛋白的主要抗原表位區(qū)設(shè)計(jì)克隆引物,通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增去除跨膜區(qū)和信號(hào)肽序列而保留主要抗原表位區(qū)片段,將編碼序列大小分別為1005 bp、1050 bp和1104 bp的CDV M、F、H基因片段分別克隆至原核表達(dá)載體p ET-30a(+)中,構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET-30a(+)-M、p ET-30a(+)-F和p ET-30a(+)-H。將各表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3),在0.4m M IPTG和37℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)4 h后,經(jīng)SDS-PAGE分析結(jié)果顯示重組質(zhì)粒p ET-30a(+)-M、p ET-30a(+)-F和p ET-30a(+)-H在大腸埃希菌中分別誘導(dǎo)表達(dá)出分子質(zhì)量為43 ku、40 ku和46 ku的重組蛋白,大小與預(yù)期相符,主要以不溶性包涵體形式存在。Western blot鑒定結(jié)果顯示M、F、H重組蛋白均能被犬抗CDV多克隆抗體特異性識(shí)別。以經(jīng)Ni-NTA親和層析純化后的M、F和H重組蛋白分別免疫BALB/c小鼠和兔,經(jīng)3次免疫后采血,分離血清,制備鼠抗CDV M、F和H蛋白多克隆抗體及兔抗H蛋白多克隆抗體。2、犬瘟熱病毒M、F和H蛋白重組桿狀病毒的構(gòu)建、鑒定與表達(dá)為構(gòu)建表達(dá)具有天然構(gòu)象的犬瘟熱病毒M、F和H蛋白,分別將CDV LP弱毒株M、F和H基因ORF克隆至p Fast Bac?1載體中,測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化至DH10Bac?感受態(tài)細(xì)胞,同源重組獲得穿梭質(zhì)粒r Bacmid-M、r Bacmid-F和r Bacmid-H,將其分別轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞獲得相應(yīng)重組桿狀病毒rp FB-M、rp FB-F和rp FB-H。分別以上述制備鼠抗CDV M、F和H蛋白多克隆抗體及兔抗H蛋白多克隆抗體對(duì)相應(yīng)重組桿狀病毒進(jìn)行IFA鑒定,結(jié)果顯示各重組病毒在感染細(xì)胞的細(xì)胞膜上均可見(jiàn)特異性熒光反應(yīng);同時(shí),對(duì)各重組桿狀病毒感染細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測(cè),結(jié)果可見(jiàn)分子量分別為37 ku、63 ku和68 ku左右的重組基質(zhì)膜蛋白(r M)、融合蛋白(r F)和血凝素蛋白(r H)條帶,表明各重組桿狀病毒構(gòu)建成功,基質(zhì)蛋白M、囊膜糖蛋白F和H在桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)中獲得了成功表達(dá)。綜上所述,本研究利用桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)成功表達(dá)了CDV M、F和H蛋白,并能與制備的鼠多克隆抗體及兔多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng),均具有良好的反應(yīng)原性,這為后期利用重組桿狀病毒包裝犬瘟熱病毒VLPs,開(kāi)發(fā)安全、有效的CDV VLPs疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:In recent years , virus - like particles ( VLPs ) have been used as one of the hot spots and the future development trend of virus vaccine . The expression of M , F , H protein in insect cells and the preparation of polyclonal antibody are discussed . The results show that the recombinant plasmid pET - 30a ( + ) - M , pET - 30a ( + ) - F and p - ET - 30a ( + ) - H are respectively cloned into prokaryotic expression vector pET - 30a ( + ) . The recombinant plasmid pET - 30a ( + ) - M , p - ET - 30a ( + ) - F and p - ET - 30a ( + ) - H are respectively induced to express the recombinant proteins with molecular mass of 43 ku , 40 ku and 46 ku . The results of Western blot analysis showed that M , F and H recombinant proteins were specifically identified by anti - CDV polyclonal antibody in dogs . It has good reactivity , which lays a foundation for the development of safe and effective CDV VLPs vaccine .

【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.655

【參考文獻(xiàn)】

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1 李金中,夏咸柱,胡桂學(xué),范志強(qiáng),鄒嘯環(huán),武銀蓮,黃耕,袁書(shū)智,喬貴林;我國(guó)犬瘟熱病毒的生態(tài)學(xué)調(diào)查研究[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);1999年04期

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本文編號(hào)：1672784