本文選題：成纖維細(xì)胞　切入點(diǎn)：體細(xì)胞核移植　出處：《安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：體細(xì)胞核移植(somatic cells nuclear transfer,SCNT)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)和基因編輯等技術(shù)的突破與完善,為醫(yī)學(xué)、畜牧業(yè)和生物學(xué)基礎(chǔ)研究等帶來了新的曙光。作為一種重要的經(jīng)濟(jì)動物,豬在解剖學(xué)、生理學(xué)等方面比小鼠更接近于人類,正逐漸成為人類異種移植和再生醫(yī)學(xué)研究中理想的生物學(xué)模型。自SCNT和i PSCs取得成功以來,它們在豬上均有較大發(fā)展,但SCNT還存在效率低和克隆后代死亡率高等問題,而豬iPSCs也存在基因整合等安全性問題。其中,源頭細(xì)胞作為兩種重編程技術(shù)中的首個(gè)關(guān)鍵步驟,適宜的源頭細(xì)胞可能為解決重編程中效率和安全等關(guān)鍵問題提供思路。本研究首先建立了豬胚胎成纖維細(xì)胞系(porcine embryonic fibroblasts,PEFs)和成年豬耳源成纖維細(xì)胞系(adult porcine ear fibroblasts,APEFs);并以PEFs、APEFs、仔豬脂肪干細(xì)胞系(adipose-derived stem cells,ADSCs)為供體細(xì)胞進(jìn)行SCNT,探討對重構(gòu)胚胎發(fā)育能力的影響;其次,利用多西環(huán)素(DOX)誘導(dǎo)的慢病毒系統(tǒng)將PEFs、APEFs和ADSCs重編程為iPSCs,并對各自的重編程效率進(jìn)行對比分析。旨在借助SCNT和i PSCs兩種經(jīng)典的細(xì)胞重編程方法,綜合考慮各因素,優(yōu)選出供體細(xì)胞及其重編程方案;最后,通過原核表達(dá)的方法制備具有穿透細(xì)胞膜功能的可溶性的EGFP-11R和SOX2-11R重組蛋白,以期為制備其它重組蛋白和以蛋白誘導(dǎo)獲取無基因整合的iPSCs奠定基礎(chǔ)。具體試驗(yàn)及結(jié)果如下:試驗(yàn)一成纖維細(xì)胞建系和SCNT——通過酶消化、倒置貼壁培養(yǎng)和尼龍網(wǎng)過濾等方法,本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建了PEFs,APEFs和ADSCs三株細(xì)胞系。在取材方面,因APEFs來自成年公豬耳緣皮膚組織,取材方便、成本低,在動物良種資源保護(hù)上具有很大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值;ADSCs取自于仔豬背部皮下組織,操作復(fù)雜;而PEFs取自于健康懷孕母豬的胎兒,取材和操作繁瑣、成本高。在增殖和細(xì)胞狀態(tài)方面,發(fā)現(xiàn)增殖數(shù)率由高到低依次為ADSCs,PEFs和APEFs;ADSCs和PEFs折光性好、形態(tài)飽滿,APEFs狀態(tài)則略差。在作為供體細(xì)胞支持重構(gòu)胚發(fā)育方面,以囊胚率做為指標(biāo),發(fā)現(xiàn)ADSCs和PEFs顯著高于APEFs(P0.05)。在重構(gòu)胚質(zhì)量方面,以囊胚總細(xì)胞數(shù)為指標(biāo),發(fā)現(xiàn)PEFs源重構(gòu)胚的質(zhì)量顯著優(yōu)于APEFs(P0.05)。試驗(yàn)二成纖維細(xì)胞與ADSCs源豬iPSCs建系——通過DOX誘導(dǎo)的慢病毒系統(tǒng),成功使三種細(xì)胞發(fā)生了重編程過程,且都能觀察到AP陽性克隆。通過對接種細(xì)胞數(shù)和克隆總數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)豬ADSCs的重編程效率高于其它兩株成纖維細(xì)胞系,與SCNT結(jié)果一致。在PEFs源i PSCs的建立過程中,先后觀察到兩類克隆,這證明重編程是一個(gè)逐漸緩慢的過程,持續(xù)的單克隆傳代可能有利于重編程程度的提高。PEFs源iPSCs表現(xiàn)為AP陽性,且在體外培養(yǎng)時(shí)無需額外添加藥物DOX;在mRNA水平上,外源性O(shè)CT4,SOX2,KLF4和C-MYC表達(dá)顯著高于源頭細(xì)胞,且內(nèi)源性O(shè)CT4,SOX2,KLF4和C-MYC也得到了激活,OCT4和SOX2表現(xiàn)尤為明顯。在蛋白水平上,該株iPSCs表達(dá)OCT4和NANOG蛋白。在分化潛能方面,體外能形成擬胚體,形成效率在3%左右。通過逆轉(zhuǎn)錄PCR發(fā)現(xiàn),外源性基因OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC已整合到細(xì)胞基因組。試驗(yàn)三可溶性EGFP-11R和SOX2-11R重組蛋白的制備——依次通過載體構(gòu)建、蛋白表達(dá)條件摸索和純化、蛋白鑒定與轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞等步驟,在大腸桿菌提取物的上清中成功獲取且純化出了EGFP-11R和SOX2-11R重組蛋白,且驗(yàn)證其都具有穿透細(xì)胞膜能力。其中,可溶性EGFP-11R重組蛋白的最佳表達(dá)條件為37℃和0.5 mol/L IPTG誘導(dǎo)4h,而可溶性SOX2-11R重組蛋白的最佳表達(dá)條件為28℃和0.5 mol/L IPTG誘導(dǎo)4h。綜上所述,本研究首先建立了PEFs和APEFs細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)APEFs在取材、建細(xì)胞系成本、動物福利和良種資源保護(hù)方面要優(yōu)于PEFs和ADSCs。然后,同ADSCs一起對三者的重構(gòu)胚胎發(fā)育能力進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)在以囊胚率為指標(biāo)的重構(gòu)胚發(fā)育方面ADSCs和PEFs要優(yōu)于APEFs,在囊胚質(zhì)量方面,發(fā)現(xiàn)PEFs源囊胚的總細(xì)胞數(shù)要高于APEFs源囊胚。此外,利用iPSCs技術(shù)對三種細(xì)胞的重編程潛能進(jìn)行了再次檢測,發(fā)現(xiàn)ADSCs顯著高于PEFs和APEFs,而PEFs和APEFs間差異不顯著,這與SCNT的結(jié)果相符;然而,建立的PEFs源iPSCs存在基因整合,限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。最后,利用原核表達(dá)系統(tǒng)制備了在上清中表達(dá)且純化、具有穿透細(xì)胞膜功能的EGFP-11R重組蛋白和SOX2-11R重組蛋白,為利用蛋白制備無基因整合的豬iPSCs奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Somatic cell nuclear transfer (somatic cells nuclear transfer, SCNT), induced pluripotent stem cells (induced pluripotent stem cells, iPSCs) and perfect, and gene editing techniques for a breakthrough in medicine, animal husbandry and biological basic research has brought a new dawn. As an important economic animal, pig in anatomy and physiology on closer than mice to humans, is becoming a biological model of transplantation of human xenograft and regenerative medicine ideal. Since SCNT and I PSCs to succeed, they have made great progress in swine, but SCNT also has low efficiency and high mortality of cloned offspring, and pig iPSCs has gene integrated security the problem. Among them, the source of cells as the two reprogramming in the first key step, the source of cells may provide suitable ideas for solving the key problem of efficiency and safety of reprogramming. This study established a porcine fetal fibroblast cell line (porcine embryonic, fibroblasts, PEFs) and adult pig ear fibroblast cell line (adult porcine ear fibroblasts, APEFs); and PEFs, APEFs, pig fat stem cell line (adipose-derived stem cells, ADSCs SCNT) as the donor cells, to explore the influence of the ability the reconstruction of embryonic development; secondly, the use of doxycycline (DOX) lentiviral system induced by PEFs, APEFs and ADSCs programming is iPSCs, and the reprogramming efficiency were analyzed. By means of a cell reprogramming method to SCNT and I PSCs two classic, comprehensive consideration of various factors, selected donor cells and reprogramming scheme; finally, through the method of preparation of prokaryotic expression of soluble cell membrane penetration function of EGFP-11R and SOX2-11R recombinant protein, in order for the preparation of other heavy group protein and protein induced by free access Lay the foundation for the integration of iPSCs gene. The specific test and the results are as follows: 10% test of fiber cell line and SCNT by enzyme digestion, inverted adherent and nylon mesh filter method, we successfully constructed PEFs, APEFs and ADSCs three cell lines. In terms of materials, because of APEFs from adult boar ear skin organization, convenient, low cost, has great practical value in animal breeding resources protection; ADSCs is taken from the subcutaneous tissue of piglets, complex operation; while PEFs from healthy pregnant sows were fetal, and the operation is complicated, the cost is high. The proliferation and cell state, found that proliferation rate is high to low is ADSCs, PEFs and APEFs; ADSCs and PEFs with good refraction, plump shape, APEFs is slightly worse. As donor cells support the development of reconstructed embryos, as the index to the blastocyst rate, ADSCs and PEFs were found Higher than APEFs (P0.05). The quality of reconstructed embryos, the total cell number of blastocyst as index, PEFs found the source of the reconstructed embryo quality was significantly better than that of APEFs (P0.05). The lentivirus system test 20% cells and ADSCs swine iPSCs lines, induced by DOX, the success of the three cell reprogramming process, and can be observed in AP positive clones. The total number of clones and through statistical analysis found that pigs inoculated cells, ADSCs reprogramming efficiency is higher than that of the other two strains of fibroblast cell lines, consistent with the SCNT results. In the process of building the PEFs source I PSCs, has observed two types of clones, which proved heavy programming is a gradual process, continuous passage may help monoclonal reprogramming to improve the degree of.PEFs source iPSCs showed AP positive, and no need of additional drug DOX in vitro; at the level of mRNA, exogenous OCT4, SOX2, KLF4 and C-MYC The source was significantly higher than in cells, and endogenous OCT4, SOX2, KLF4 and C-MYC have also been activated, OCT4 and SOX2 is obvious. At the protein level, the expression of OCT4 and NANOG protein in the strain iPSCs. The differentiation potential in vitro, to form embryoid bodies, the formation efficiency of around 3%. Found through reverse transcription PCR exogenous gene, OCT4, SOX2, KLF4 and C-MYC had been integrated into the cell genome. Test three soluble EGFP-11R and SOX2-11R recombinant protein preparation, followed by protein expression vector, and explore the conditions of purification, and turn into the cell steps of protein identification, in Escherichia coli extracts was successfully obtained and purified EGFP-11R and the recombinant protein SOX2-11R, and verify it has to penetrate the cell membrane. The soluble recombinant EGFP-11R protein of the optimal expression conditions of 37 DEG C and 0.5 mol/L IPTG induced by 4h, and the soluble recombinant protein SOX2-11R White the optimal expression conditions of 28 DEG C and 0.5 mol/L IPTG induced by 4h. in this study, we established a PEFs and APEFs cell lines were found in the APEFs cell line, construction cost, animal welfare and seed resource protection is superior to the PEFs and then ADSCs., together with ADSCs of the three reconstructed embryos developmental ability test in ADSCs and PEFs, that is better than APEFs for the development of reconstructed embryos to blastocyst rate index, the quality of blastocysts, found that the total number of cells in blastocysts was higher than that of PEFs source APEFs source blastocysts. In addition, the use of iPSCs technology on the three cell reprogramming potential were detected again, found that ADSCs was significantly higher than that of PEFs and APEFs however, no significant difference between PEFs and APEFs, which is consistent with the results of SCNT; however, the establishment of the PEFs source iPSCs gene integration, limiting its further application. Finally, the expression system was prepared in the supernatant by prokaryotic The recombinant protein and SOX2-11R recombinant protein, which express and purify the cell membrane function, have laid the foundation for the preparation of gene free porcine iPSCs with EGFP-11R.

【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S828

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本文編號：1652344