本文選題：新孢子蟲(chóng)　切入點(diǎn)：巨噬細(xì)胞　出處：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：新孢子蟲(chóng)病是由犬新孢子蟲(chóng)寄生于宿主細(xì)胞內(nèi)所引起的一種多種動(dòng)物共患的原蟲(chóng)病,臨床上可引起懷孕母畜流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎;還可引起新生幼畜的先天性神經(jīng)系統(tǒng)和運(yùn)動(dòng)障礙性疾病。該病分布范圍廣,感染率高,對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前,由于新孢子蟲(chóng)生活史尚不清楚,尚無(wú)有效防治新孢子蟲(chóng)的藥物和疫苗。新孢子蟲(chóng)感染宿主細(xì)胞后,首先會(huì)被DC細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別,進(jìn)行抗原的捕獲和呈遞。其中,巨噬細(xì)胞在機(jī)體對(duì)外來(lái)病原清除的過(guò)程中,既可以通過(guò)抗原提呈作用來(lái)激活T細(xì)胞,還可以通過(guò)分泌IL-12等細(xì)胞因子激活Th1細(xì)胞,介導(dǎo)Th1類(lèi)型的免疫應(yīng)答反應(yīng),是一種在抵抗新孢子蟲(chóng)感染過(guò)程中起著十分關(guān)鍵作用的免疫細(xì)胞。但是,由于巨噬細(xì)胞也屬于有核細(xì)胞,因此新孢子蟲(chóng)也會(huì)將巨噬細(xì)胞作為寄生的宿主細(xì)胞之一。在機(jī)體抵抗新孢子蟲(chóng)感染的過(guò)程中,巨噬細(xì)胞不僅可以捕獲和提呈抗原,還可以分泌多種促炎性細(xì)胞因子來(lái)輔助機(jī)體進(jìn)行免疫應(yīng)答。IL-12是一種主要由巨噬細(xì)胞,DC細(xì)胞等APC細(xì)胞分泌,參與機(jī)體早期免疫應(yīng)答的促炎性細(xì)胞因子,對(duì)于介導(dǎo)寄生于細(xì)胞內(nèi)的病原微生物所引起的細(xì)胞免疫應(yīng)答有著十分重要的作用。IL-12可以促進(jìn)NK細(xì)胞活化分泌IFN-γ。研究表明,IL-12和IFN-γ在參與宿主抵抗新孢子蟲(chóng)免疫應(yīng)答反應(yīng)的同時(shí),還可以激活氧自由基和一氧化氮等代謝產(chǎn)物,與其共同作用直接殺死新孢子蟲(chóng)。但是,寄生蟲(chóng)為了能在宿主體內(nèi)生存,形成了一套逃避宿主免疫保護(hù)反應(yīng)的能力,稱為免疫逃避。其中抑制細(xì)胞因子分泌是寄生蟲(chóng)免疫逃避的方式之一。研究發(fā)現(xiàn),弓形蟲(chóng)可以通過(guò)抑制IL-12的分泌在感染早期逃避宿主的免疫應(yīng)答;mi RNA和組蛋白修飾等表觀遺傳學(xué)修飾對(duì)于調(diào)控IL-12基因的表達(dá)具有一定影響。但是目前,新孢子蟲(chóng)感染引起宿主細(xì)胞IL-12分泌變化的規(guī)律和調(diào)控IL-12分泌的表觀遺傳學(xué)修飾機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)新孢子蟲(chóng)感染巨噬細(xì)胞引起IL-12的動(dòng)態(tài)變化、mi RNAs和組蛋白修飾對(duì)IL-12分泌的調(diào)控等研究,闡明了表觀遺傳學(xué)修飾對(duì)新孢子蟲(chóng)感染的巨噬細(xì)胞IL-12表達(dá)的影響。新孢子蟲(chóng)感染巨噬細(xì)胞引起IL-12的動(dòng)態(tài)變化通過(guò)密度梯度離心的方式純化新孢子蟲(chóng)速殖子,用來(lái)感染小鼠腹腔分離的原代巨噬細(xì)胞。收集感染后6h、12h、18h、24h、36h的細(xì)胞上清,檢測(cè)IL-12的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,在6h時(shí)可以檢測(cè)到IL-12的表達(dá),但是在18h內(nèi),IL-12均處于較低的表達(dá)水平。24h檢測(cè)到IL-12的表達(dá)量開(kāi)始升高,36h時(shí)IL-12的表達(dá)量進(jìn)一步升高。表明新孢子蟲(chóng)在感染小鼠巨噬細(xì)胞后,會(huì)在前18h抑制巨噬細(xì)胞IL-12的表達(dá)。新孢子蟲(chóng)感染的巨噬細(xì)胞mi RNA對(duì)IL-12的調(diào)控使用新孢子蟲(chóng)感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,提取感染后6h、12h、18h、24h、36h巨噬細(xì)胞的總RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,用Real time PCR的方法對(duì)與IL-12分泌相關(guān)的六種mi RNA(mi R-221、mi R-155、mi R-146a、mi R-10a、mi R-21、mi R-187)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)mi R-187的變化趨勢(shì)與IL-12分泌的變化趨勢(shì)一致,其余mi RNA均未發(fā)現(xiàn)具有明顯意義的變化趨勢(shì)。之后,用新孢子蟲(chóng)感染轉(zhuǎn)染了mi R-187激動(dòng)劑與抑制劑的巨噬細(xì)胞,收集6h、12h、18h、24h、36h的細(xì)胞上清,檢測(cè)IL-12的表達(dá)情況。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了mi R-187激動(dòng)劑的巨噬細(xì)胞,IL-12的表達(dá)量具有一定程度的上升,而轉(zhuǎn)染了mi R-187抑制劑的巨噬細(xì)胞,IL-12的表達(dá)量略有下降。表明mi R-187在新孢子蟲(chóng)感染的巨噬細(xì)胞中,可以促進(jìn)IL-12的表達(dá)。對(duì)mi R-187可能作用的靶標(biāo)基因進(jìn)了預(yù)測(cè),使用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)重組載體Luc基因表達(dá)的變化。結(jié)果表明在共轉(zhuǎn)染了mi R-187和含有靶標(biāo)基因重組載體的試驗(yàn)組中,Luc2的表達(dá)率明顯下降,而在共轉(zhuǎn)染了mi R-187和含有突變靶標(biāo)基因重組載體的試驗(yàn)組中,Luc2的表達(dá)率沒(méi)有變化。表明mi R-187可以和預(yù)測(cè)的靶標(biāo)基因相互作用,阻礙Luc2基因的表達(dá)。新孢子蟲(chóng)感染的巨噬細(xì)胞IL-12啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白修飾收集新孢子蟲(chóng)感染后18h的巨噬細(xì)胞,使用H3K27me2、H3K4me3、H3K9/K14ac抗體進(jìn)行Ch IP試驗(yàn),使用Real time PCR對(duì)IL-12p40啟動(dòng)子區(qū)和IL-12p35啟動(dòng)子區(qū)的啟動(dòng)子變化進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,在H3K27me2試驗(yàn)組中,IL-12p40啟動(dòng)子區(qū)的啟動(dòng)子數(shù)量明顯上升,但在其余位點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)明顯變化。表明新孢子蟲(chóng)感染巨噬細(xì)胞后,可以通過(guò)改變H3K27me2的變化來(lái)調(diào)控IL-12p40的表達(dá)。綜上所述,本研究,發(fā)現(xiàn)了新孢子蟲(chóng)感染小鼠巨噬細(xì)胞后,可延遲IL-12的表達(dá)并引起4種相關(guān)mi RNAs的表達(dá)呈現(xiàn)不同的動(dòng)態(tài)變化,其中mi R-187對(duì)新孢子蟲(chóng)感染后的巨噬細(xì)胞IL-12表達(dá)具有一定影響。表明新孢子蟲(chóng)可以通過(guò)抑制mi R-187的表達(dá)和調(diào)節(jié)IL-12p40啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3K27me2修飾的方式降低小鼠巨噬細(xì)胞IL-12的表達(dá)。從表觀遺傳學(xué)角度解析了新孢子蟲(chóng)在感染早期,通過(guò)延遲IL-12分泌從而有助于其建立感染的免疫逃避機(jī)制。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S852.723

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1652185