本文選題：HP-PRRSV　切入點：IFN-β　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(Highly Pathogenetic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,HP-PRRSV)是PRRSV經(jīng)過突變形成的具有更強致病性的毒株,能夠引起豬的高熱癥狀,懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎等繁殖障礙,新生仔豬和育肥豬出現(xiàn)呼吸道疾病且生長緩慢。病毒或細菌等病原微生物與巨噬細胞表面的受體結合以后,與受體發(fā)生相互作用,并刺激巨噬細胞等分泌I型干擾素(interferon,IFN)和抗病毒細胞因子,其中IFN-beta(IFN-β)是在病毒感染過程中具有重要作用的I型IFN的成員之一。但是某些病毒或細菌被巨噬細胞吞噬后不僅不被降解,反而抑制宿主分泌IFN-β等天然免疫應答反應,在巨噬細胞等免疫細胞中感染和增殖,HP-PRRSV就是典型的代表。HP-PRRSV感染抑制宿主的I型IFN介導的天然免疫應答反應,例如抑制IFN-β的表達,然而HP-PRRSV對宿主的天然免疫應答反應的抑制(如IFN-β的表達)及其機理還不十分清楚。本文主要是通過分析MARC-145和豬肺泡巨噬細胞(Porcine alveolar macrophages,PAM)免疫調(diào)控通路RIG-I中重要基因IRF3、CBP等在HP-PRRSV感染前后表達水平及其定位等特征,探討PRRSV受體基因變異對PRRSV感染的影響,研究HP-PRRSV抑制宿主的IFN-β表達的機制。主要結果如下:(1)HP-PRRSV感染抑制MARC-145細胞中的IFN-β的mRNA表達水平。感染(+HP-PRRSV)的MARC-145細胞中的IFN-β的表達量在檢測的5個時間點(1hpi,12 hpi,24 hpi,36 hpi,48 hpi)均低于非感染的對照組(-HP-PRRSV)細胞的表達,同時也發(fā)現(xiàn)感染(+HP-PRRSV)和非感染的對照組(-HP-PRRSV)中的IFN-β的表達量非常微弱,無法有效的反映其變化趨勢和不利于后期研究。為了更有效地開展研究,利用常用的IFN的刺激劑Poly(I:C)處理MARC-145細胞后,IFN-β的表達量顯著增加。然而,Poly(I:C)刺激和提高的IFN-β的表達水平同樣被HP-PRRSV顯著抑制,而且在MARC-145細胞(Poly(I:C)+HP-PRRSV)中IFN-β的表達量變化趨勢與感染的(+HP-PRRSV)MARC-145細胞中的相似。因此,采用Poly(I:C)處理的MARC-145細胞作為對照組,Poly(I:C)和HP-PRRSV處理的MARC-145細胞作為試驗組開展后續(xù)研究。試驗組(Poly(I:C)+HP-PRRSV)MARC-145細胞的ifn-β的表達量顯著低于對照組(poly(i:c))。因此后期的試驗側重于研究hp-prrsv對ifn-β表達的抑制機理。(2)hp-prrsv感染抑制marc-145細胞中的ifn-β蛋白表達量。檢測了試驗組(poly(i:c)+hp-prrsv)和對照組(poly(i:c))marc-145細胞的ifn-β的蛋白表達量,結果和(1)中的ifn-β的mrna表達量的趨勢一致。(3)hp-prrsv感染抑制肺泡巨噬細胞(pam)ifn-β的mrna和蛋白表達。進一步檢測試驗組和對照組prrsv自然感染的豬肺泡巨噬細胞pam(porcinealveolarmacrophages)的ifn-β表達,pam細胞中ifn-β的mrna和蛋白表達趨勢一致,而且pam與marc-145細胞的結果一致。(4)hp-prrsv感染抑制ifn-β的重要調(diào)控因子irf3的表達。在marc-145細胞與pam細胞中,分別檢測了試驗組和對照組的irf3的mrna、總蛋白的表達量,試驗組的表達量均低于對照組,而且irf3的mrna、總蛋白的表達的趨勢一致。(5)hp-prrsv感染抑制irf3的核轉位。在marc-145細胞與pam細胞中,進一步檢測了試驗組和對照組的細胞質(zhì)和細胞核的irf3的表達量。結果表明,試驗組的細胞質(zhì)和細胞核的irf3都分別低于對照組,而且試驗組細胞核的irf3蛋白非常少以致無法檢測。推測hp-prrsv感染能夠減少irf3由胞質(zhì)向核轉移的數(shù)量。(6)hp-prrsv感染抑制irf3的磷酸化。在marc-145細胞與pam細胞中,檢測了試驗組和對照組的irf3的磷酸化蛋白的表達量,試驗組的表達量均低于對照組。推測hp-prrsv感染通過抑制irf3蛋白的磷酸化來抑制irf3的核轉位。(7)hp-prrsv感染抑制irf3蛋白ser396位點的磷酸化。生物信息學對irf3的蛋白結構和功能預測表明,ser396隱蔽在irf3蛋白的螺旋結構和卷曲結構的交界處,而且已經(jīng)有研究表明該位點對irf3磷酸化具有重要作用,因此推測hp-prrsv感染通過抑制ser396位點暴露來抑制irf3磷酸化。(8)hp-prrsv感染對環(huán)磷酸腺苷應答元件結合蛋白(cbp)表達沒有顯著影響。irf3進入細胞核通過與cbp結合形成復合物才能與ifn-β的啟動子結合,促進ifn-β表達。marc-145細胞與pam細胞中的感染試驗組和對照組的cbp的mrna表達量均沒有明顯差異,推測hp-prrsv感染對cbp的表達沒有顯著影響。(9)PAM細胞膜的PRRSV受體基因變異對HP-PRRSV感染的風險具有重要影響。HP-PRRSV感染的風險性與CD163和CD169的單核苷酸突變(SNP)相關。HP-PRRSV被細胞表面的受體識別并吞噬后才能進入細胞,CD163和CD169是兩種重要的受體。Logistic回歸方法對524頭豬(康復豬n=298,患病豬n=95,死亡豬n=41,健康豬n=90)共6個SNPs的基因型進行感染風險分析,共得到3種基因型與HP-PRRSV感染相關,包括CD169 C1654A的AA基因型、CD169 C4175T的CT基因型、CD163 A2552G的AA基因型,比其它的基因型感染HP-PRRSV的風險小一些。說明具有吞噬功能的CD163和CD169的SNPs與感染HP-PRRSV的風險性有關。(10)受體CD169和CD163基因的單核苷酸突變影響受體介導的吞噬功能。蛋白結構和功能預測軟件分析結果表明,CD169受體的3個SNPs均能導致氨基酸的改變,而且都位于免疫球蛋白區(qū)域,影響蛋白穩(wěn)定性。這3個SNPs通過改變蛋白穩(wěn)定性來影響受體介導的吞噬功能。CD163受體的2個SNPs位于結合病原體的結構域,雖然不改變氨基酸,但是通過影響密碼子的偏好性進而改變翻譯的蛋白的數(shù)量。另一個SNP也位于結合病原體的結構域,通過改變氨基酸影響受體的吞噬功能。本研究初步認為HP-PRRSV通過影響IRF3二級和三級結構而降低了IRF3的磷酸化水平,IRF3蛋白的較低磷酸化水平影響和降低了IRF3進入細胞核的數(shù)量,減少了蛋白IRF3和CBP結合形成的復合物,并且減少了復合物與IFN-β啟動子結合機會,從而抑制IFN-β的轉錄和蛋白表達,進而使HP-PRRSV抑制了宿主的免疫反應而感染侵害宿主。此外,PAM細胞膜上的PPRSV受體基因(CD163和CD169)的變異和不同基因型也影響HP-PRRSV感染風險性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 魏振明,吳平,戴朝杰,李怡英,程由銓;偽狂犬病弱毒疫苗的研究——接種豬的細胞免疫應答[J];中國獸醫(yī)科技;1990年11期

2 唐宗青;;TLR7配體Loxoribine對調(diào)節(jié)性T細胞抑制作用的解除[J];上海交通大學學報(農(nóng)業(yè)科學版);2007年06期

3 焦新安,焦新安,Richard　Lo-man,Pierre Guermonprez,Edith Deriauf,Sophie　Burgaud,Brigitte Gicquel,Nathalie Winter,Claude Leclerc,劉秀梵;重組卡介苗誘導T細胞免疫應答的分子、細胞機理研究[J];中國預防獸醫(yī)學報;2000年S1期

4 孫建和,嚴亞賢,陳懷青,陸承平;鯽魚的細胞免疫應答研究[J];上海農(nóng)學院學報;1998年02期

5 史元元,楊本升;布氏菌M_5弱毒苗接種豚鼠的細胞免疫應答[J];獸醫(yī)大學學報;1983年04期

6 齊鵬;肖進;王楠;巴利民;;MTT法評價豬口蹄疫合成肽疫苗的細胞免疫應答[J];中國獸藥雜志;2011年02期

7 溫建新;李俊;周順;任慧英;劉文華;鄒玲;徐文;牛鐘相;王金寶;;含CpG序列PRRSV ORF5基因真核表達質(zhì)粒在小鼠的細胞免疫應答[J];中國獸醫(yī)學報;2009年12期

8 王靜;高偉;安選;鐘卿;胡懷東;胡鵬;任紅;;Th17與Treg細胞免疫失衡在慢性乙型病毒性肝炎發(fā)病過程中的調(diào)節(jié)作用[J];西南大學學報(自然科學版);2012年06期

9 張云峰;劉福元;蔡宏;呼西旦;宋振忠;徐雪萍;;結核分枝桿菌三價DNA疫苗的體液免疫與細胞免疫應答[J];中國獸醫(yī)科學;2011年11期

10 朱珠;傅志強;洪煬;韓艷輝;張e，

本文編號：1642696