談暠媛
（湖北省獸藥監(jiān)察所，武漢  430070）

摘要：四環(huán)素類藥物是一類廣譜抗生素，常被應用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)中，其藥物殘留會嚴重危害人體健康。目前國內(nèi)對四環(huán)素類藥物殘留問題越來越重視，檢測其殘留量的方法成為研究的重點，同時國家也制定了相關的檢測標準。該文對國內(nèi)幾種四環(huán)素類藥物殘留的主要檢測方法的優(yōu)缺點進行了比較和研究。
關鍵詞：四環(huán)素類藥物殘留；檢測方法；比較
中圖分類號：S859.84                文獻標識碼：B                文章編號：1007－273X（２０１３）０7-0063-04

四環(huán)素類藥物是由放線菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，對革蘭氏陽性及陰性細菌、衣原體、支原體和立克次氏體等均有良好的抑制作用。四環(huán)素類抗生素主要包括6種，即金霉素、土霉素、四環(huán)素、強力霉素（多西環(huán)素）、美他環(huán)素和米諾環(huán)素。其中前3種是天然品，后3種是人工半合成品，又稱新四環(huán)素。
目前，我國在養(yǎng)殖生產(chǎn)環(huán)節(jié)中普遍存在濫用、亂用藥物的不良現(xiàn)象，危害了人民群眾的身體健康。四環(huán)素類藥物在動物源性食品中的殘留問題日益嚴重，已引起相關部門的高度重視。藥物殘留問題嚴重影響了我國在國際市場中的正常貿(mào)易，阻礙了畜牧業(yè)的健康發(fā)展。
1  四環(huán)素類藥物殘留對人體的危害
抗生素類藥物的長期過量使用會導致細菌產(chǎn)生交叉耐藥性。長期食用含抗生素類藥物殘留的食物會導致人體內(nèi)耐藥性細菌的增多，人體本身的耐藥性也會增強，抗生素的藥效會不斷降低，使用正常的劑量可能達不到理想的藥效，必須不斷加大給藥劑量才可能產(chǎn)生藥效，嚴重時甚至會完全失效，從而加大治療疾病的困難性。
人們食用有藥物殘留的食品后可能出現(xiàn)中毒反應，如四環(huán)素類抗生素易阻礙兒童牙齒發(fā)育和骨骼生長，敵百蟲在一定條件下會形成具有劇烈毒性的3  效益分析
    由表3可，散養(yǎng)雞和圈養(yǎng)雞通過養(yǎng)殖對比，散養(yǎng)雞飼養(yǎng)周期長，耗料高，但肉質好，售價高，平均每只可獲利10.4元，而舍養(yǎng)的雞由于活動量小，生長快，耗料低，但疾病多，死亡率高，銷售價格低，平均每只僅獲利6.4元，比散養(yǎng)雞少獲利38.5%。敵敵畏，氯霉素則可能引起顆粒性細胞缺乏癥和再生障礙性貧血。某些藥物殘留極易對人體和動物產(chǎn)生包括致癌、致畸、致突變的“三致”作用。
四環(huán)素類藥物易與人體中的鈣結合，會在骨骼和牙齒中沉積，抑制骨骼和牙齒的生長發(fā)育，尤其對胎兒和嬰幼兒的影響較大，還可導致牙齒持久染色變黃，俗稱四環(huán)素牙。四環(huán)素類藥物可在肝臟中沉積，長期累積會造成肝臟和腎臟的損傷。此外，四環(huán)素類藥物還具有刺激性，可抑制蛋白質的合成，甚至有時產(chǎn)生致過敏反應。國家目前對動物源性食品中的四環(huán)素類藥物殘留限量有嚴格的規(guī)定，并相繼開展四環(huán)素類藥物殘留檢測方法的研究。
2  國內(nèi)獸藥殘留分析技術
    獸藥殘留分析是研究動物組織和動物樣品中殘留獸藥組分的分析技術。其具有以下幾個特點：需檢測的物質組分濃度極低，大多數(shù)的殘留濃度水平為1 ~1 000μg/kg；藥物在動物體內(nèi)經(jīng)吸收、分布、代謝和排泄?jié)舛茸兓^大，含量不穩(wěn)定；檢測藥物殘留的樣品一般為動物組織和動物產(chǎn)品，其成分復雜，其中含有較多的干擾雜質，對檢測造成一定的影響，能否將雜質和待測藥物分開是獸藥殘留分析中存在的主要問題。由于動物種類不一，動物體各組織的位置不一樣，其組成成分有極為明顯的差異，雜質干擾的程度與雜質峰出現(xiàn)的時間均有差別，所以獸藥殘留檢測方法的通用性差。
    現(xiàn)代的殘留分析的發(fā)展方向是追求更高的靈敏度、更低的檢測限；分析儀器的集成化、微型化和便攜化；高選擇性；多殘留分析；聯(lián)用分析；在線分析；現(xiàn)場快速分析等。
3  國內(nèi)四環(huán)素類藥物殘留量的檢測方法與比較
四環(huán)素類抗生素具有抑菌范圍廣、抗菌作用強、價格便宜等優(yōu)點，在養(yǎng)殖業(yè)中被普遍應用，但是在防治動物疾病的同時，也帶來一些負面的影響。抗生素類藥物的殘留日益嚴重，逐漸危害到人體的健康。國內(nèi)外目前對四環(huán)素類抗生素的殘留問題都十分關注，很多專家學者都在研究四環(huán)素類抗生素殘留的檢測方法。隨著檢測技術的不斷發(fā)展，檢測的藥物種類逐漸增多，檢測限越來越低，檢測方法也越來越簡便。
目前國內(nèi)無公害水產(chǎn)品中四環(huán)素、金霉素、土霉素的最大殘留限量均為100 μg/kg。中國農(nóng)業(yè)部第235號公告中也規(guī)定了四環(huán)素、金霉素、土霉素的最大殘留限量均為100 μg/kg［1］。歐共體對四環(huán)素類抗生素類在各類食源性動物組織中的最大殘留限量是：動物肝臟600 μg/kg，卵200 μg/kg，肌肉100 μg/kg，乳汁100 μg/kg。聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織食品法典委員會制定在魚和有殼類的肌肉中四環(huán)素、土霉素、金霉素的最高殘留限量為200 μg/kg。美國食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定進口水產(chǎn)品中土霉素最高殘留限量是10 μg/kg。
四環(huán)素類抗生素殘留的檢測方法主要有高效液相色譜法和高效液相串聯(lián)質譜法。由于液質聯(lián)用儀器昂貴，成本較高，盡管其具有精密度高、同時檢測的藥物種類更多的優(yōu)點，但仍然不如高效液相色譜法普遍。下面簡述幾種國內(nèi)現(xiàn)有的檢測四環(huán)素類抗生素殘留的方法。
3.1  畜禽產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物殘留的檢測
GB/T 5009.116-2003  畜、禽肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素殘留量的測定（高效液相色譜法）［2］：以5%高氯酸溶液為提取液，振蕩離心，取上清液過0.45 μm濾膜，即可上機檢測。該方法色譜柱選用ODS-C18柱，流動相為乙腈︰0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液（pH2.5）=35︰65，流速是1.0 mL/min，檢測波長為355 nm，柱溫為室溫。該方法檢出限為土霉素0.15 mg/kg，四環(huán)素0.20 mg/kg，金霉素0.65 mg/kg。
    GDFB 234-2004 動物源性食品中四環(huán)素族殘留量的檢驗方法  高效液相色譜法［3］：該方法中檢測的四環(huán)素種類是土霉素、四環(huán)素和金霉素。這3種四環(huán)素類抗生素是目前國內(nèi)檢測最多的幾種四環(huán)素類抗生素。GDFB 234-2004標準中采用紫外檢測器，色譜柱選用C18柱，流動相為乙腈︰0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液（pH2.5）=23︰77，流速是1.0 mL/min，檢測波長為355 nm，柱溫25 ℃。該方法采用5%高氯酸溶液作為提取液，離心后上清液過Oasis HLB萃取小柱，最后用甲醇洗脫，定容后作為供試品，其最低檢測濃度是土霉素0.02 mg/kg，四環(huán)素0.04 mg/kg，金霉素0.04 mg/kg。
農(nóng)業(yè)部958號公告-2-2007  豬雞可食性組織中四環(huán)素類殘留檢測方法-高效液相色譜法［4］：該方法主要適用于豬、雞的肌肉、肝臟和腎臟組織，檢測的藥物種類有四環(huán)素、土霉素、多西環(huán)素。樣品經(jīng)提取后離心，上清液過Oasis HLB萃取小柱，洗脫液水浴吹干后用草酸溶液復溶。該方法選用C18柱，檢測波長為355 nm，柱溫35 ℃，流動相為0.01 mol/L草酸溶液︰乙腈︰甲醇，梯度洗脫，0~10 min 3者的比例為83︰11︰6，10~25 min 3者的比例為60︰30︰10，流速為1.0 mL/min。該方法在肌肉中的檢測限均為10 μg/kg，定量限均為20 μg/kg；在肝臟中的檢測限均為25 μg/kg，定量限均為50 μg/kg；在腎臟中的檢測限均為30 μg/kg，定量限均為50 μg/kg�；厥章试�70%~110%。
農(nóng)牧發(fā)［1998］ 17號 金霉素在動物可食性組織中殘留的高效液相色譜檢測方法［5］：此方法適用于雞和豬的肌肉、肝臟、腎臟和脂肪的檢測。樣品經(jīng)提取、離心后過C18柱，用6 mL 0.01 mol/L草酸-甲醇溶液洗脫，用水定容至10 mL，過濾后即可上儀器檢測。該法選用C18色譜柱，檢測波長為350 nm，流動相為甲醇︰乙腈︰0.01 mol/L草酸溶液=1.5︰1.5︰2.0（pH=2.0），流速是1.5 mL/min，該方法的回收率為80%±20%，批內(nèi)變異系數(shù)≤10%，批間變異系數(shù)≤15%。
GB/T 20764-2006可食動物肌肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素殘留量測定  液相色譜-紫外檢測法［6］：該方法適用于牛肉、羊肉、豬肉、雞肉和兔肉組織的殘留檢測。方法中采用紫外檢測器，檢測波長為350 nm，色譜柱是Mightsil RP-18 GP，柱溫25 ℃，流動相的成分為乙腈︰甲醇︰0.01 mol/L草酸溶液=2︰1︰7。該標準中4種藥物的檢出限均為5 μg/kg。其實驗步驟為樣品經(jīng)提取離心，上清液過Oasis HLB萃取小柱和羧酸型陽離子交換柱，經(jīng)流動相洗脫后經(jīng)液相色譜-紫外檢測器檢測。土霉素的平均回收率為84.6%~96.8%，四環(huán)素的平均回收率為75.1%~89.3%，金霉素的平均回收率為77.0%~90.8%，強力霉素的平均回收率為82.2%~84.9%。
農(nóng)業(yè)部1025號公告-12-2008  雞肉、豬肉中四環(huán)素類藥物殘留檢測  液相色譜-串聯(lián)質譜法［7］：該標準適用于豬肉、雞肉中四環(huán)素、土霉素及金霉素的殘留檢測。方法中樣品經(jīng)提取、離心后過Oasis HLB萃取小柱，用甲醇洗脫，氮氣吹干后用30%甲醇水溶液1.0 mL溶解殘余物，過濾后作為供試品。該法選用色譜柱Xbridge C18色譜柱，柱溫20 ℃，流動相為A：0.3%的甲醇乙腈溶液，B：0.3%的甲酸水溶液，梯度洗脫：0~10 min，10%A線性變化至35%A ；10~15 min，35%A線性變化至10%A；15~25 min，10%A。流速為0.2 mL/min。質譜條件選用電噴霧離子源，正離子掃描，多反應監(jiān)測，電離電壓2.5 kV，，源溫80 ℃，霧化溫度200 ℃，錐孔氣流速：50 L/h，霧化氣流速310 L/h。該方法檢測限為5 ng/g，定量限為10 ng/g，回收率在60%~120%。
GB/T 5009.116-2003主要針對的是畜禽肉中的四環(huán)素類抗生素殘留檢測。該方法中使用5%高氯酸溶液作為提取液，對除土霉素、四環(huán)素和金霉素之外的其他四環(huán)素類藥物的提取、回收率較差，且該方法中樣品凈化步驟較為簡單，對干擾雜質的去除不徹底，影響目標藥物的檢測。農(nóng)業(yè)部958號公告-2-2007中的提取液可以提取大多數(shù)四環(huán)素類藥物，提取效果好，且在檢測過程中，將洗脫液吹干后用草酸復溶可以降低檢測基線對目標藥物的干擾，同時該方法選用梯度洗脫，可以達到很好的分離效果。GB/T 20764-2006可以同時檢測4種四環(huán)素類藥物，檢測種類較多。在樣品純化過程中使用了Oasis HLB柱代替以前常用的C18色譜柱，增加類羧酸型陽離子交換柱凈化，步驟雖然較復雜，但凈化效果比較好，樣品基質雜質干擾小。農(nóng)業(yè)部1025號公告-12-2008用的是液相色譜-串聯(lián)質譜法，檢測限和定量限均比高效液相色譜法低，具有高靈敏性、分析時間快等優(yōu)點。
王蕾等［8］建立的高效液相色譜法可測定7種四環(huán)素類藥物殘留。該法采用DiamonsilTMC18ODS色譜柱，檢測波長為270 nm，流速為1.0 mL/min，甲醇︰乙腈︰0.01mol/L草酸為流動相梯度洗脫。雖然該方法并沒有對任何實際樣品中7種四環(huán)素類抗生素的殘留進行實際檢測，但是該方法的建立對實際樣品的分析提供了一定的參考。該研究方法中檢測的四環(huán)素類藥物種類較多，流速比較快，如需檢測實際樣品中7種四環(huán)素類藥物殘留量時，會有某些四環(huán)素類藥物和樣品基質中的雜質分離效果不理想，所以在實際操作中需要對流速、樣品純化等進行適當?shù)恼{整，以達到滿意的分離度。
3.2  水產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物殘留的檢測
    黃志勇等［9］建立了高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中四環(huán)素、土霉素、金霉素殘留量的方法。該方法采用高效液相色譜儀-紫外可見檢測器，反向色譜柱，以4%高氯酸溶液作為提取液，流動相為乙腈︰0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液（pH 2.8）=18:82（V/V），流速為1 mL/min，檢測波長為355 nm，柱溫40 ℃。最低檢測限為土霉素45 μg/kg，四環(huán)素41 μg/kg，金霉素80 μg/kg。平均回收率為70.0%~90.0%。該方法純化步驟簡單，適用于樣品雜質相對較少的水產(chǎn)品，如使用同種方法檢測畜禽類等其他樣品組織成分相對復雜的樣品時，其樣品純化效果不佳，且該方法中檢測的四環(huán)素類藥物種類較少，且都是國內(nèi)檢測方法中最常見的種類。
3.3  蜂蜜中四環(huán)素類藥物的檢測
    GB/T 18932.4-2002 蜂蜜中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素殘留量的測定方法液相色譜法［10］：該方法采用的是紫外檢測器，色譜柱選用的是Bondapak C18，檢測波長為350 nm，柱溫25 ℃，流動相的成分比例為乙腈︰甲醇︰0.01 mol/L草酸溶液=20︰10︰70，流速為1.5 mL/min，進樣量100 μL，4種藥物的檢出限均為10 μg/kg。其具體步驟是以30mL 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液（pH4.0）為提取液溶解樣品，離心，上清液過Oasis HLB萃取小柱，用乙酸乙酯洗脫樣品，洗脫液再過羧酸型陰離子交換柱，經(jīng)流動相洗脫后供液相色譜檢測。此方法與GB/T 20764-2006中的樣品純化步驟有部分類似，其檢測的四環(huán)素類藥物種類相同，均為土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素。在樣品純化過程中同樣使用了Oasis HLB柱代替以前常用的C18色譜柱，增加類羧酸型陰離子交換柱凈化，凈化效果比較好，樣品基質雜質干擾小。
3.4  牛奶中四環(huán)素類藥物殘留的檢測
 農(nóng)業(yè)部1025號公告-20-2008 動物性食品中四環(huán)素藥物殘留檢測酶聯(lián)免疫吸附法［11］：該方法是在樣品組織中加入8.0 mL檸檬酸緩沖液提取其中的四環(huán)素類藥物，渦旋混勻后振蕩30 min，10 000 r/min高速離心10 min，取上清液5.0 mL過C18固相萃取小柱，用1.0 mL 20 mmol/L草酸-甲醇溶液（取草酸1.8 g，加甲醇溶解并稀釋定容到1 000 mL）洗脫，用稀釋液稀釋后供酶聯(lián)免疫法測定。其在肌肉組織中的檢測限低于15 ng/g，添加濃度為100 ng/g樣品其回收率為40%~120%。該方法適用于牛奶，牛、豬、雞的肌肉，豬肝臟和帶皮魚肉中四環(huán)素、土霉素、金霉素及強力霉素殘留的檢測，其檢測結果并不精確，只適合于快速篩選大量樣品。
4  小結與討論
    目前國內(nèi)研究四環(huán)素類藥物殘留檢測方法有很多，使用的方法有高效液相色譜法、液質串聯(lián)法、薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法等。提取液多采用弱酸性溶液，如5%高氯酸、5%三氯乙酸和EDTA緩沖液。樣品純化一般使用C18或Oasis HLB萃取小柱，但在GB/T 18932.4-2002和GB/T 20764-2006兩種方法中樣品純化過程同時使用了Oasis HLB萃取小柱和羧酸型陰/陽離子交換柱，凈化步驟雖然復雜了，但是凈化效果更好。流動相大多選用乙腈︰磷酸二氫鈉和乙腈︰甲醇︰草酸溶液，且pH需調節(jié)至酸性。
     上述的幾種四環(huán)素類藥物殘留的檢驗方法中以高效液相色譜法最為普遍，具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，但是檢驗過程中受樣品基質中的雜質干擾較大，可同時檢測的藥物種類偏少，檢測多種四環(huán)素類藥物時分離度不理想，必要時使用梯度洗脫才能達到理想的分離效果。液相色譜-串聯(lián)質譜法具有更高的靈敏度，可以達到更低的檢出限和定量限，檢測過程中受樣品基質的干擾較小，可以同時檢測更多種類的四環(huán)素類藥物，但是儀器成本較高，樣品純化過程更為繁瑣。其他的檢測方法一般適合篩選樣品，不適合精確的定量檢測。
    目前檢測四環(huán)素類藥物的種類集中在金霉素、土霉素、四環(huán)素，對強力霉素、美他環(huán)素和米諾環(huán)素等新四環(huán)素的檢測方法研究較少，特別是缺乏同時檢測4種以上四環(huán)素類藥物殘留的方法。檢測的樣品種類也以畜禽產(chǎn)品居多，水產(chǎn)品、蜂蜜和牛奶中的四環(huán)素類藥物殘留的檢測方法較少，且能檢測的四環(huán)素類藥物種類較少，在今后的工作中應加強對這方面的研究，可嘗試通過調整色譜條件和改進樣品處理方法來同時檢測不同基質中多種四環(huán)素類藥物殘留，以滿足不同動物源性組織中四環(huán)素類藥物殘留量檢測的需要。
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