本文選題：綿羊　切入點(diǎn)：體外受精　出處：《內(nèi)蒙古大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：體外受精技術(shù)作為胚胎工程研究領(lǐng)域的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù),廣泛地應(yīng)用于家畜繁殖領(lǐng)域,為家畜遺傳保種等提供了技術(shù)保障。綿羊是我國(guó)重要的家畜之一,也是家畜體外受精最早研究的動(dòng)物,但其體外受精效率卻明顯低于其他家畜。除此之外,干細(xì)胞在家畜領(lǐng)域具有非常大的潛在應(yīng)用價(jià)值。綿羊類干細(xì)胞的體外培養(yǎng),不僅可以作為研究哺乳動(dòng)物發(fā)育的體外模型,也可以用于治療和育種,應(yīng)用前景廣闊,但目前綿羊干細(xì)胞的研究仍處于起步階段。溶血磷脂酸(Lysophosphatidicacid,LPA)是一種小分子甘油磷脂,在多種動(dòng)物細(xì)胞中具有生長(zhǎng)因子和激素樣活性。LPA通過(guò)結(jié)合其耦聯(lián)G蛋白的各種受體,激活下游多條信號(hào)通路,產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng),如促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、遷移、侵襲、黏附和形態(tài)發(fā)生等。有研究表明,LPA可促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟,提高胚胎發(fā)育率,對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。通過(guò)在體外受精及囊胚接種細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中添加LPA,探究LPA對(duì)綿羊體外受精的促進(jìn)機(jī)制以及囊胚接種細(xì)胞培養(yǎng)的影響,為家畜體外受精及囊胚接種細(xì)胞建系提供參考。本研究首先探討LPA對(duì)綿羊體外受精早期胚胎發(fā)育的影響。我們選取了兩種成熟液,成熟液1與成熟液2,與兩種SOF液進(jìn)行組合,通過(guò)比較不同體系間的成熟率、卵裂率和囊胚率,最終找到最優(yōu)的體外受精的體系即成熟液1+SOF2。然后,我們?cè)诰d羊卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精和受精卵體外培養(yǎng)過(guò)程中添加不同濃度的LPA,統(tǒng)計(jì)不同LPA濃度對(duì)體外受精過(guò)程中成熟率、卵裂率及囊胚率的影響。結(jié)果顯示,當(dāng)LPA濃度為0.1μM、1μM及10μM之間時(shí),隨著LPA濃度的增加,綿羊卵母細(xì)胞體外成熟率、卵裂率、囊胚率逐漸上升,且囊胚形態(tài)正常;但當(dāng)LPA濃度達(dá)到15 μM時(shí),成熟率、卵裂率、囊胚率出現(xiàn)下降,并且囊胚形態(tài)發(fā)生異常,胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)聚集不正常,囊胚內(nèi)部出現(xiàn)分區(qū),不能發(fā)育成為優(yōu)質(zhì)的囊胚。為了檢測(cè)在不同濃度LPA的刺激下,LPARs及干性標(biāo)記基因OCT-4與CDX-2在早期胚胎中的表達(dá)量,我們通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了LPAR1 LPAR2、LPAR3、LPAR4、LPAR5、LPAR6、OCT-4 與 CDX-2 在 2 細(xì)胞期、4 細(xì)胞期、8細(xì)胞期、桑葚胚期和囊胚期中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,在不同LPA濃度下,LPARs在早期胚胎各個(gè)時(shí)期均有表達(dá),其中LPAR2的表達(dá)量明顯高于其他5種受體的表達(dá)量,LPAR4表達(dá)量?jī)H低于LPAR2,LPAR1與LPAR3表達(dá)量較接近,LPAR5與LPAR6表達(dá)量較為接近,但LPAR1、LPAR3、LPAR5與LPAR6表達(dá)量極低。LPAR2與LPAR4表達(dá)量在2細(xì)胞時(shí)期到囊胚期呈現(xiàn)上升趨勢(shì),且當(dāng)LPA濃度為0-10μM時(shí),隨著LPA濃度的增加而增加,而當(dāng)LPA濃度為15μM時(shí),二者的表達(dá)量卻出現(xiàn)抑制。為了探討LPA濃度對(duì)囊胚接種細(xì)胞培養(yǎng)的影響,我們?cè)谀遗呓臃N細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加不同濃度的LPA,觀察不同體系下囊胚接種細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,通過(guò)免疫熒光染色與實(shí)時(shí)熒光定量PCR來(lái)檢測(cè)細(xì)胞中干細(xì)胞多能性標(biāo)志物OCT4及滋養(yǎng)層干細(xì)胞標(biāo)志基因CDX2的表達(dá)。我們選取GFF為飼養(yǎng)層,2i為基礎(chǔ)培養(yǎng)體系,與Wnt-3a、hLif、Forskolin及LPA組合形成8種培養(yǎng)體系。結(jié)果顯示只添加2i培養(yǎng)液囊胚接種細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,且出現(xiàn)分化現(xiàn)象;培養(yǎng)體系添加2i與Wnt-3a,貼壁囊胚長(zhǎng)出扁平片狀結(jié)構(gòu),單層細(xì)胞下有液體積聚成穹窿狀結(jié)構(gòu),與滋養(yǎng)層干細(xì)胞相似,呈OCT4與CDX2陽(yáng)性;體系為2i加hLif,貼壁囊胚細(xì)胞克隆較為致密,其形態(tài)類似于小鼠胚胎干細(xì)胞,成三維立體生長(zhǎng),OCT4呈陽(yáng)性CDX2呈陰性。在2i與hLif培養(yǎng)體系中添加Forskolin,囊胚接種細(xì)胞呈扁平片狀生長(zhǎng),呈OCT4與CDX2陽(yáng)性。取不同濃度LPA與2i、hLif、Forskolin組合,發(fā)現(xiàn)隨著LPA濃度的增加,囊胚接種細(xì)胞呈扁平片狀生長(zhǎng),細(xì)胞克隆的細(xì)胞核和細(xì)胞輪廓清晰,片狀細(xì)胞克隆邊緣出現(xiàn)增厚,甚至出現(xiàn)類似于牛胚胎干細(xì)胞的穹窿狀結(jié)構(gòu),出現(xiàn)形成滋養(yǎng)層干細(xì)胞的趨勢(shì)。在OCT4與CDX2的免疫熒光染色中,熒光強(qiáng)度在一定程度上隨著LPA濃度的增加而增強(qiáng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,OCT4與CDX2表達(dá)量隨LPA濃度的增大而增大,但過(guò)高濃度LPA卻會(huì)抑制OCT4與CDX2表達(dá)量。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可見(jiàn)LPA在綿羊體外受精早期胚胎發(fā)育及囊胚接種細(xì)胞培養(yǎng)中有著重要作用,本研究為家畜體外受精及干細(xì)胞研究提供一定的理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S826

【參考文獻(xiàn)】

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2 木其日;阿拉坦高勒;;溶血磷脂酸受體3與相關(guān)疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J];世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘;2015年93期

3 劉春霞;趙瑞媛;周歡敏;;綿羊胚胎干細(xì)胞的分離與增殖培養(yǎng)[J];蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2015年05期

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5 陳博;趙云程;林嘉鵬;孫曉巖;陳雪梅;黃俊成;;無(wú)血清無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系在綿羊胚胎干細(xì)胞分離中的應(yīng)用[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2014年06期

6 任衛(wèi)青;陳亮;和小娥;何俊丹;王新莊;;綿羊類胚胎干細(xì)胞的分離與克隆[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2012年05期

7 萬(wàn)鵬程;石文艷;代蓉;周平;石國(guó)慶;;綿羊體外受精及胚胎發(fā)育分子調(diào)控研究進(jìn)展[J];畜牧與獸醫(yī);2012年04期

8 萬(wàn)鵬程;石文艷;代蓉;周平;劉守仁;石國(guó)慶;;不同培養(yǎng)體系對(duì)綿羊體外受精胚胎發(fā)育及細(xì)胞凋亡的影響[J];新疆農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年07期

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10 皮文輝,張樹(shù)山,倪建宏,楊永林,石國(guó)慶,劉守仁;發(fā)情羊血清、肝素對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外受精的影響[J];中國(guó)草食動(dòng)物;2004年01期

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本文編號(hào)：1619106