本文選題：牛傳染性鼻氣管炎病毒　切入點(diǎn)：gD蛋白　出處：《江西農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)又名牛皰疹病毒Ⅰ型(Bovine hepersvirusⅠ,BHV-1),是引起牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)的病原,自20世紀(jì)50年代美國(guó)首次報(bào)道以后,已在世界范圍內(nèi)廣泛分布,給養(yǎng)牛業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。gD蛋白是牛傳染性鼻氣管炎病毒的囊膜糖蛋白,能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。但由于病毒能潛伏于薦神經(jīng)節(jié)及三叉神經(jīng)節(jié),常規(guī)抗體難以進(jìn)入細(xì)胞而無(wú)法清除病毒。隨著單鏈抗體的發(fā)展及應(yīng)用,可有效解決此難題,單鏈抗體是一種小分子的基因工程抗體,由抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過一段連接肽連接而成,是抗原結(jié)合的最小功能單位,其分子量小、穿透能力強(qiáng),可穿透血管壁進(jìn)入靶組織。本研究利用自行設(shè)計(jì)的兼并引物,以PCR方法從雜交瘤細(xì)胞的cDNA中擴(kuò)增單鏈抗體重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因,通過重疊延伸PCR及Linker序列獲得完整的單鏈抗體基因。運(yùn)用大腸桿菌及昆蟲細(xì)胞分別表達(dá)單鏈抗體基因。用大腸桿菌表達(dá)時(shí),將單鏈抗體基因克隆至pET28a質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL(DE3)誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)的單鏈抗體蛋白大小為30kD,能特異性結(jié)合抗His單克隆抗體。進(jìn)一步對(duì)以包涵體形式的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行變性、純化和復(fù)性后,獲得了單鏈抗體融合蛋白。Western blot、抗原捕獲ELISA、IFA的結(jié)果均表明該單鏈抗體蛋白能夠特異性地與IBR病毒抗原結(jié)合。微量病毒中和試驗(yàn)及噬斑減數(shù)試驗(yàn)進(jìn)一步顯示,該單鏈抗體蛋白能和IBR病毒發(fā)生中和反應(yīng),并可以有效地抑制病毒在牛腎細(xì)胞(Madin-darby Bovine Kidney,MDBK)中復(fù)制;用昆蟲細(xì)胞表達(dá)時(shí),將單鏈抗體基因克隆至轉(zhuǎn)移載體pFastBac-Lic-Bse中,構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體pFB-VH-VL,將其轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中獲得重組rBacmid-VH-VL,并轉(zhuǎn)染至Sf9細(xì)胞中獲得單鏈抗體蛋白,分子大小約為30 kD。Western blot結(jié)果顯示昆蟲細(xì)胞表達(dá)的單鏈抗體蛋白,不僅能被抗His標(biāo)簽的抗體識(shí)別,而且能特異性結(jié)合IBRV gD蛋白。間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明該單鏈抗體蛋白能夠識(shí)別感染MDBK的IBRV。通過比較研究,以兩種表達(dá)系統(tǒng)均能制備出單鏈抗體蛋白,但大腸桿菌表達(dá)的單鏈抗體對(duì)牛傳染性鼻氣管炎病毒和gD蛋白均具有更強(qiáng)的結(jié)合能力和抗病毒活性。鑒于其制備簡(jiǎn)單且成本低廉,該單鏈抗體將在未來(lái)開發(fā)牛傳染性鼻氣管炎的特異性診斷方法和有效的治療藥物時(shí),提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
[Abstract]:Bovine bovine rhinotracheitis virus (IBRV), also known as bovine herpesvirus type I hepersvirus 鈪，

本文編號(hào)：1607204