本文選題：牛1型腺病毒(BAdV1)　切入點：感染性克隆　出處：《西北農(nóng)林科技大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：人5型腺病毒(HAdV5)目前已作為一種優(yōu)秀的載體廣泛用于基因治療和疫苗研究。但是由于人群中普遍存在的HAdV5載體免疫,HAdV5載體的應用受到很大限制。為克服HAdV5存在的以上缺陷,目前主要通過兩個途徑來解決。一是從病毒改造或替代角度解決,包括HAdV5衣殼改造、使用HAdV稀有血清型、使用動物腺病毒等。二是通過黏膜途徑免疫,主要為口服和滴鼻免疫。在病毒改造或替代方面,由于動物腺病毒與人腺病毒之間沒有交叉免疫反應,因此可作為HAdV5的理想替代載體。在黏膜免疫途徑方面,考慮到滴鼻免疫被報道存在神經(jīng)毒性,口服免疫安全便捷,因此可用于口服的腺病毒疫苗載體近年來受到廣泛的關注。牛1型腺病毒(BAdV1)分離自健康牛腸道,與人腺病毒之間無血清交叉反應,同時在腸道具有高穩(wěn)定性,基于BAd V1的疫苗載體可同時從兩個途徑克服HAdV5載體應用瓶頸。因此本研究首次嘗試構建基于健康牛腸道1型腺病毒的載體系統(tǒng)——BAdV1感染性克隆,后續(xù)有望用于BAdV1的基因功能研究和基于BAd V1載體的基因治療和口服疫苗研究。本研究主要分為2部分:1.通過細菌同源重組構建BAdV1感染性質(zhì)粒本研究首先根據(jù)BAdV1的基因序列合成含有I-SceI限制性內(nèi)切酶識別位點的LITR和RITR,并分別和擴增的BAdV1 E1及E4片段進行overlap PCR獲得BAdV1的左右同源臂(LITR+E1和RITR+E4),隨后分別克隆到pUC18載體上經(jīng)測序表明成功構建了穿梭質(zhì)粒pUC18-E1-E4。野生型BAdV1在VIDO DT1細胞上擴增后,提取線狀病毒基因組。Afl II線性化的pUC18-E1-E4質(zhì)粒通過與提取的BAdV1基因組在大腸桿菌BJ5183中同源重組,經(jīng)限制性酶切圖譜分析表明成功構建了在BAdV1全基因組引入I-SceI酶切位點的BAdV1感染性質(zhì)粒pUCBAdV1。2.重組病毒BAdV1在VIDO DT1細胞上的拯救環(huán)狀重組基因組pUCBAdV1轉染能夠表達I-SceI內(nèi)切酶的VIDO DT1細胞后成功包裝并傳代了重組BAdV1。這也證實了VIDO DT1可以拯救并增殖BAdV1。此外,重組BAdV1和wtBAdV1在VIDO DT1細胞增殖能力相當都能達到較高的滴度,表明本研究構建的BAdV1的重組載體系統(tǒng)可為其將來載體疫苗的開發(fā)研究奠定了重要的基礎。
[Abstract]:Human adenovirus type 5 (HAdV5) has been widely used as an excellent vector for gene therapy and vaccine research. However, the application of HAdV5 vector, which is widely used in the population, has been greatly restricted. In order to overcome the above defects of HAdV5, human adenovirus type 5 (HAdV5) has been widely used in gene therapy and vaccine research. At present there are two main ways to solve the problem. One is from the perspective of virus transformation or substitution, including the transformation of HAdV5 capsid, the use of rare serotypes of HAdV, the use of animal adenovirus, etc. The other is immunization through mucosal channels. Mainly oral and nasal immunization. In virus modification or substitution, because there is no cross immune reaction between animal adenovirus and human adenovirus, it can be used as the ideal alternative vector of HAdV5. In view of the reported neurotoxicity of nasal drip immunization and the safety and convenience of oral immunization, the vector of adenovirus vaccine which can be used in oral administration has attracted wide attention in recent years. Bovine adenovirus type 1 (BAdV1) is isolated from healthy bovine intestines, There is no serum cross reaction with human adenovirus and high stability in the intestine. The vaccine vector based on BAdV1 can overcome the bottleneck of HAdV5 vector application from two ways at the same time. Therefore, this study is the first attempt to construct the vector system of BAdV1 infectious clone based on healthy bovine enterotype 1 adenovirus. This study is mainly divided into two parts: 1. Construction of BAdV1 infectious plasmids by homologous recombination of bacteria. The first step of this study was to construct BAdV1 infectious plasmids based on BAdV1. Sequence synthesis of LITR and RITR containing I-SceI restriction endonuclease recognition site, and overlap PCR with amplified BAdV1 E1 and E4 fragments to obtain LITR E1 and RITR E4 of BAdV1, respectively, were cloned into pUC18 vector and sequenced. The shuttle plasmid pUC18-E1-E4was successfully constructed. The wild type BAdV1 was amplified on VIDO DT1 cells. The linearized pUC18-E1-E4 plasmid of linear virus genome. AflII was homologous recombined with the extracted BAdV1 genome in Escherichia coli BJ5183. Restriction endonuclease map analysis showed that the BAdV1 infectious plasmid pUCBAdV1.2was successfully constructed by introducing I-SceI restriction site into the whole BAdV1 genome. The recombinant virus BAdV1 was transfected into VIDO DT1 cells to express I-SceI endonuclease. VIDO DT1 cells were successfully packaged and subcultured into recombinant BAdV1.This also confirmed that VIDO DT1 could save and proliferate BAdV1.In addition, Both recombinant BAdV1 and wtBAdV1 could achieve high titers in VIDO DT1 cells, indicating that the recombinant vector system of BAdV1 constructed in this study could lay an important foundation for the development and study of vector vaccine in the future.
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S855.3

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 徐紹建;李俊;曹帥;時建立;周順;徐文;張秀美;王金寶;;豬圓環(huán)病毒2型全序列分析及感染性克隆的構建[J];中國獸醫(yī)雜志;2009年01期

2 劉光清,劉在新,謝慶閣;口蹄疫感染性克隆疫苗的發(fā)展前景[J];動物醫(yī)學進展;2003年03期

3 王德忠;;口蹄疫感染性克隆疫苗的發(fā)展前景[J];吉林畜牧獸醫(yī);2006年04期

4 王光祥;鄭海學;尚佑軍;劉艷紅;常艷燕;田宏;吳錦艷;陳江濤;劉湘濤;;豬圓環(huán)病毒2型感染性克隆的構建[J];中國獸醫(yī)科學;2009年11期

5 王明亮;刁有祥;紀巍;孔義波;高繼明;;豬圓環(huán)病毒2型感染性克隆的構建[J];中國獸醫(yī)學報;2011年03期

6 呂健;韋祖樟;高飛;鄭海紅;童光志;袁世山;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒強弱毒株嵌合感染性克隆的構建及鑒定[J];畜牧獸醫(yī)學報;2012年10期

7 李祥健;張建武;呂健;余丹丹;姚火春;袁世山;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒嵌合感染性克隆的構建和應用[J];生物工程學報;2008年09期

8 朱麗杰;李剛;曲哲會;王君偉;;口蹄疫病毒全長cDNA感染性克隆的研究進展[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2008年02期

9 楊虹;;口蹄疫感染性克隆疫苗的制備與發(fā)展[J];北京農(nóng)業(yè);2009年18期

10 邵小雪;周雙海;謝俊嶺;冉多良;;豬圓環(huán)病毒1型感染性克隆的構建[J];中國獸醫(yī)科學;2011年02期

相關會議論文 前10條

1 周雙海;謝俊嶺;;豬圓環(huán)病毒2型感染性克隆構建的比較分析[A];“生泰爾”杯全國養(yǎng)豬技術征文大賽——中國畜牧獸醫(yī)學會養(yǎng)豬學分會五屆三次理事會暨生豬產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新發(fā)展論壇論文集[C];2012年

2 劉長明;危艷武;陸月華;張朝霞;袁婧;黃立平;;豬圓環(huán)病毒1型感染性克隆的構建與病毒拯救[A];中國畜牧獸醫(yī)學會畜牧獸醫(yī)生物技術學分會暨中國免疫學會獸醫(yī)免疫分會第七次研討會論文集[C];2008年

3 李祥健;張建武;呂健;余丹丹;姚火春;袁世山;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒嵌合感染性克隆的構建和應用[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會第三屆豬病防控學術研討會論文集[C];2008年

4 李薇;余興龍;羅維;白霞;李潤成;黎滿香;葛猛;王亞;向衛(wèi)軍;李晶;;三種亞群PCV-2感染性克隆的構建及體內(nèi)外感染性試驗[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學術研討會論文集（上冊）[C];2009年

5 徐卓菲;司有輝;劉瑞峰;錢平;李祥敏;陳煥春;;豬瘟病毒兔化弱毒株感染性克隆平臺的構建[A];2006年度學術研討會論文摘要匯編[C];2006年

6 陳義鋒;趙亞榮;趙建增;;PRRSV感染性克隆及其在疫苗研究中的應用[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會第三屆豬病防控學術研討會論文集[C];2008年

7 張考;仲飛;李秀錦;陳慧慧;李文艷;溫潔霞;;含綠色熒光蛋白基因的PRRSV感染性克隆的制備及特性分析[A];全國動物生理生化第十二次學術交流會論文摘要匯編[C];2012年

8 孔義波;張興曉;姜世金;趙欽;孫亞妮;;內(nèi)源性禽白血病病毒SD0501株感染性克隆的構建及鑒定[A];山東畜牧獸醫(yī)學會禽病學專業(yè)委員會第一次學術研討會論文集[C];2009年

9 潘夢;楊小蓉;郭鑫;張大丙;楊漢春;;3型鴨甲肝病毒C-GY株全長感染性克隆的構建和病毒拯救的鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會第十五次學術研討會論文集[C];2010年

10 李爽;章麗嬌;孫海港;蘇文良;韓博;蘇敬良;;鴨BYD病毒全長感染性克隆的構建與拯救病毒鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會第十二次人獸共患病學術研討會暨第六屆第十四次教學專業(yè)委員會論文集[C];2012年

相關博士學位論文 前8條

1 張善瑞;高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒及其弱毒感染性克隆的構建和應用[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2010年

2 黃勤鋒;豬繁殖與呼吸綜合征病毒的感染性克隆及其復制子載體的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2009年

3 于可響;鴨坦布蘇病毒生物學特性、基因組特征、診斷方法以及感染性克隆的研究[D];揚州大學;2013年

4 于敏;豬戊型肝炎病毒全基因組序列分析及感染性克隆的構建[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2007年

5 耿合員;人冠狀病毒NL63中國株全基因組的測序與感染性克隆構建[D];中國疾病預防控制中心;2014年

6 張輝;偽狂犬病毒間質(zhì)蛋白UL14功能研究及TK～-/gG～-株感染性克隆構建[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2007年

7 劉少寧;PRRSV不同毒株感染MARC-145細胞的蛋白質(zhì)組學分析及ZCYZ株感染性克隆的拯救[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2012年

8 黃海龍;福建省HIV-1CRF01_AE流行株的表型分析、基因序列特征、膜蛋白表達及感染性克隆構建的研究[D];福建醫(yī)科大學;2007年

相關碩士學位論文 前10條

1 王利月;表達綠色熒光蛋白的北美Ⅱ型PRRSV感染性克隆的制備及特性分析[D];河北農(nóng)業(yè)大學;2015年

2 張潞;牛1型腺病毒感染性克隆的構建及拯救[D];西北農(nóng)林科技大學;2015年

3 田敬;鵝圓環(huán)病毒感染性克隆的構建及其轉染試驗[D];浙江大學;2010年

4 吳星星;豬圓環(huán)病毒2型新疆株的分離鑒定及感染性克隆的構建[D];新疆農(nóng)業(yè)大學;2012年

5 李祥健;豬繁殖與呼吸綜合征病毒嵌合感染性克隆的構建和應用[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2008年

6 鐘志成;帶有綠色熒光蛋白標記的中國馬傳染性貧血病毒疫苗株感染性克隆的構建[D];南方醫(yī)科大學;2010年

7 李長龍;豬嵴病毒全長cDNA感染性克隆的構建及拯救[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2014年

8 鄭翠玲;貓杯狀病毒全基因組序列分析和感染性克隆的構建[D];吉林大學;2007年

9 陳君豪;DHAV-1感染性克隆構建及其部分生物學活性研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2012年

10 楊揚;HCoV-OC43感染性克隆的改建與病毒拯救[D];中國疾病預防控制中心;2012年

，

本文編號：1607462