本文關(guān)鍵詞： 禽致病性大腸桿菌(APEC) arcA基因 趨化性 運動性和毒力調(diào)節(jié) 缺失株 轉(zhuǎn)錄組　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：禽致病性大腸桿菌(AvianPathogenic E.coli,APEC)是引起養(yǎng)禽業(yè)最嚴(yán)重的三種感染性疾病之一,同時它也是一種威脅人類健康的潛在食源性致病菌。本研究所用的XM(02:K1)菌株屬于大腸桿菌系統(tǒng)進化樹中的B2群,是從有敗血癥和神經(jīng)癥狀的病鴨大腦中分離出的致病菌株。已有研究發(fā)現(xiàn)這一菌株可以引起乳鼠嚴(yán)重的腦膜炎癥狀。盡管大腸桿菌的致病機理已經(jīng)得到了廣泛的研究,越來越多的研究發(fā)現(xiàn),除了已知的經(jīng)典致病因子以外,仍然存在很多潛在的致病因子。本研究中,我們選擇二元調(diào)控系統(tǒng)ArcB-ArcA中的ArcA基因進行研究,ArcB-ArcA二元調(diào)控系統(tǒng)是一種主要調(diào)控細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境中氧濃度的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),該酶促防御系統(tǒng)可以促進細(xì)菌從有氧到厭氧狀態(tài)下新陳代謝的轉(zhuǎn)換,并且可以激活細(xì)菌對抗活性氧(ROS)。本研究首次發(fā)現(xiàn)ArcA還具有調(diào)節(jié)APEC XM的毒力的作用,因此,對ArcA參與調(diào)節(jié)APEC XM的毒力的作用機制進行了探索。利用RED同源重組技術(shù)構(gòu)建了 APEC XM的arcA基因缺失株,并利用低拷貝質(zhì)粒pGEN-MCS構(gòu)建了 arcA基因的互補株,同時將pGEN-MCS質(zhì)粒導(dǎo)入arcA基因缺失株中,構(gòu)建了對照株。通過比較野生株、缺失株、互補株的生長速度以及致病力,分析aarcA對APEC XM的致病力作用。結(jié)果顯示,缺失株的生長速度稍慢于野生株和互補株,但差異不顯著。雛鴨半數(shù)致死量LD50測定的結(jié)果顯示,野生株的LD50為 3.43×104 CFU,缺失株的 LD50 為 1.49×106 CFU,互補株的 LD50 為 6.37×104 CFU。表明缺失株的毒力顯著下降,而互補株的毒力明顯恢復(fù)。提示突變株毒力降低是真正由arcA基因缺失引起的。盡管試驗結(jié)果表明arcA確實參與了 APEC XM的毒力調(diào)控,但是其毒力相關(guān)的機理仍然不清楚,因此對arcA缺失株和野生株XM分別在不同培養(yǎng)條件下進行轉(zhuǎn)錄組測序,以期找到arcA所調(diào)控的毒力相關(guān)基因。將野生株與缺失株分別在7日齡雛鴨血清和LB中微需氧條件下培養(yǎng),提取兩株菌的RNA,每組3個重復(fù),進行轉(zhuǎn)錄組測序分析。arcA基因缺失株與野生株XM的轉(zhuǎn)錄組比較結(jié)果顯示,在血清中,缺失株與野生株相比,p≤0.05,q≤0.1時,有129個基因表達(dá)量差異在2倍以上,為了驗證RNA-Seq結(jié)果的準(zhǔn)確性,我們篩選出grxA、flgB、flgK、fliC、fliD、oppB、oppD、yneI、Ildr、glc這10個基因進行熒光定量PCR驗證,結(jié)果顯示yneI、Ildr、glcF在缺失株中表達(dá)量顯著上調(diào),其余7個基因在缺失株中表達(dá)量顯著下調(diào),這與轉(zhuǎn)錄組測序分析的結(jié)果是一致的,并且所有基因熒光定量PCR的表達(dá)差異倍數(shù)均比轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果大。結(jié)果表明arcA對這些基因確實具有調(diào)節(jié)作用,同時也證實RNA-Seq的結(jié)果的真實可靠性。從轉(zhuǎn)錄組的分析結(jié)果中,在129個差異表達(dá)基因中并沒有發(fā)現(xiàn)經(jīng)典毒力因子,因此我們篩選出部分可能與大腸桿菌的致病性相關(guān)的基因,包括具有谷氨酸調(diào)控代謝功能的基因glnL、glnG,鞭毛合成功能的基因flgB、flgK、fliC、fliD、motD、motB,趨化性功能的基因cheA、cheW,檸檬酸代謝調(diào)控功能的基因citE:、citF、citC等,用熒光定量PCR進行驗證,結(jié)果顯示,這些基因在arcA缺失株中的表達(dá)水平與野生株中的存在顯著差異,且變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致,表明arcA對這些基因確實具有調(diào)控作用,因此對這些基因進行進一步的研究,以期找到毒力相關(guān)基因。本研究利用RED同源重組技術(shù),構(gòu)建了 cheA、cheAW、motAW、flgBCDEFGHIJK、fliCD、citCEFXG、glnLG基因的缺失株,以7日齡健康雛鴨作為動物模型,選取1×107CFU,1×106CFU,1×1O5CFU三個不同劑量,每10只鴨子為一組,對野生株以及7個缺失株的毒力進行測定。腹腔注射感染后連續(xù)觀察10天,記錄鴨子死亡情況,并用fisher法統(tǒng)計差異顯著性。結(jié)果顯示,在攻毒劑量為1×105CFU時,cheA和motAB基因缺失株組的死亡數(shù)均為3,野生株組死亡數(shù)為8(p0.05),差異顯著,而flgBCDEFGHIJK、fliCD、citCEFXG、glnLG、cheAW缺失株與野生株的毒力差異均不顯著。進一步的研究表明cheA、cheAW、motAB基因的缺失對APEC的體外生長并不產(chǎn)生顯著的影響。這些結(jié)果提示ArcA通過對cheA、motA、motB等趨化性以及運動性相關(guān)基因的調(diào)控,從而參與對APEC致病性的調(diào)控。據(jù)我們所知,這是關(guān)于ArcA基因致病性作用研究的首次報道。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61

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本文編號：1529372