本文關(guān)鍵詞： 黃芩苷 脂多糖 NF-κB NLRP3 仔豬外周血單核細(xì)胞　出處：《武漢輕工大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：豬場養(yǎng)殖中,斷奶仔豬易受細(xì)菌及病原體感染,引發(fā)免疫應(yīng)激。免疫應(yīng)激所引起的仔豬過度炎癥反應(yīng),嚴(yán)重影響?zhàn)B豬生產(chǎn)。脂多糖(LPS)是具有代表的一種免疫誘導(dǎo)劑,常被用來構(gòu)建動物免疫應(yīng)激模型。本課題組前期的工作中已經(jīng)成功的使用LPS建立了仔豬的免疫應(yīng)激炎癥模型。本論文通過研究不同濃度的黃芩苷對仔豬外周血單核細(xì)胞免疫應(yīng)激的影響,探索NF-κB及NLRP3信號通路在黃芩苷緩解仔豬外周血單核細(xì)胞免疫應(yīng)激性炎癥的作用。1.黃芩苷對脂多糖誘導(dǎo)仔豬外周血單核細(xì)胞NF-κB信號通路的影響建立仔豬外周血單核細(xì)胞免疫應(yīng)激性疾病體外模型。方法:采取仔豬前腔靜脈抗凝血液,依照細(xì)胞分離方法,分離得到仔豬外周血單核細(xì)胞。分別設(shè)置空白對照組、內(nèi)毒素(LPS)造模組、黃芩苷處理組(12.5、25、50和100μg/m L)。藥物組加入相應(yīng)濃度黃芩苷預(yù)處理1h后加入終濃度為1μg/m L的LPS誘導(dǎo),繼續(xù)培養(yǎng)3、16和20h,采用ELISA方法測定LPS誘導(dǎo)3h后單核細(xì)胞核蛋白和胞漿蛋白NF-κB p65比值、3h后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α的含量以及16h和20h后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6的含量;采用RT-PCR方法,測定仔豬外周血單核細(xì)胞裂解液中(LPS誘導(dǎo)刺激3h后)TNF-α和IL-6的m RNA表達(dá)量。結(jié)果:①脂多糖誘導(dǎo)3h后,仔豬外周血單核細(xì)胞核蛋白與胞漿蛋白NF-κB p65比值極顯著提高(P0.01),黃芩苷濃度分別在12.5μg/m L和100μg/m L時(shí)能夠顯著(P0.05)或極顯著(P0.01)地抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB p65蛋白的核轉(zhuǎn)移;其它濃度的黃芩苷均對NF-κB p65蛋白的核轉(zhuǎn)移有一定抑制作用,但未達(dá)顯著水平。②脂多糖誘導(dǎo)3h后,仔豬外周血單核細(xì)胞上清液中TNF-α極顯著增加(P0.01)。黃芩苷濃度在12.5μg/m L時(shí)即能顯著地(P0.05)抑制TNF-α的分泌,濃度在25、50和100μg/m L時(shí)均能夠極顯著(P0.01)的減少TNF-α的釋放。③脂多糖誘導(dǎo)16h和20h后,仔豬外周血單核細(xì)胞上清液中IL-6含量均極顯著升高(P0.01)。黃芩苷濃度在12.5μg/m L時(shí)顯著地(P0.05)抑制16h和20h后細(xì)胞上清液中IL-6的分泌;同時(shí)黃芩苷濃度在25、50和100μg/ml時(shí)均能夠極顯著地(p0.01)降低lps刺激16h和20h后細(xì)胞上清液中il-6的含量。④脂多糖誘導(dǎo)3h后,單核細(xì)胞裂解液中tnf-α和il-6mrna表達(dá)量均極顯著上調(diào)(p0.01)。黃芩苷濃度在25、50和100μg/ml時(shí)均能夠極顯著地(p0.01)抑制lps誘導(dǎo)的tnf-αmrna表達(dá)上調(diào),濃度在12.5μg/ml時(shí)也能夠顯著地(p0.05)下調(diào)tnf-αmrna表達(dá)。黃芩苷濃度在50、100μg/ml時(shí)極顯著地(p0.01)抑制il-6mrna表達(dá),濃度在12.5、25μg/ml時(shí)能夠顯著地(p0.05)抑制il-6mrna的表達(dá)。2.黃芩苷對脂多糖誘導(dǎo)仔豬外周血單核細(xì)胞nlrp3信號通路的影響建立仔豬外周血單核細(xì)胞免疫應(yīng)激性疾病體外模型。方法:將分離培養(yǎng)后所得的仔豬外周血單核細(xì)胞分別設(shè)為空白對照組、lps造模組、黃芩苷處理組(12.5、25、50和100μg/ml),藥物組加入相應(yīng)濃度黃芩苷預(yù)處理1h后加入終濃度為1μg/ml的lps誘導(dǎo),繼續(xù)培養(yǎng)3、16和20h。采用熒光顯微鏡觀察lps誘導(dǎo)3h后細(xì)胞內(nèi)活性氧(ros)含量;采用elisa法檢測lps誘導(dǎo)16h和20h后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的il-1β和il-18的蛋白表達(dá)量;采用rt-pcr法檢測lps誘導(dǎo)3h后仔豬外周血單核細(xì)胞裂解液中nlrp3、asc、caspase-1、il-1β及il-18的mrna表達(dá)量;采用熒光顯微鏡觀察lps誘導(dǎo)3h和6h后單核細(xì)胞的中晚期凋亡情況(apoptosis);采用westernblot法檢測lps誘導(dǎo)10h后仔豬外周血單核裂解液中cleavedcaspase-1p20蛋白表達(dá)量。結(jié)果:①脂多糖誘導(dǎo)3h后,仔豬外周血單核細(xì)胞內(nèi)ros表達(dá)量極顯著的增加(p0.01)。黃芩苷濃度在12.5、25、50和100μg/ml時(shí)均能夠極顯著地(p0.01)抑制細(xì)胞內(nèi)ros的釋放。②脂多糖誘導(dǎo)16h和20h后,仔豬外周血單核細(xì)胞上清液中的il-1β和il-18的蛋白表達(dá)量均極顯著地(p0.01)增加。黃芩苷濃度在50μg/ml時(shí)能夠顯著地(p0.05)抑制16h和20h后細(xì)胞上清液中il-1β和il-18的蛋白分泌,濃度在100μg/ml能夠極顯著地(p0.01)抑制16h和20h后單核細(xì)胞上清液中il-1β和il-18的分泌。③脂多糖誘導(dǎo)3h后,仔豬外周血單核細(xì)胞nlrp3、il-1β和il-18的mrna表達(dá)均極顯著上調(diào)(p0.01),但asc及caspase-1的mrna表達(dá)量差異不顯著。25、50和100μg/ml的黃芩苷均能夠極顯著地(p0.01)下調(diào)nlrp3mrna的表達(dá)量,黃芩苷濃度在12.5μg/m L時(shí)能夠顯著地(P0.05)抑制NLRP3 m RNA的表達(dá)量。黃芩苷濃度在50和100μg/m L時(shí)顯著地(P0.05)抑制IL-1βm RNA的表達(dá)效果,其余濃度可在一定程度上降低IL-1βm RNA的表達(dá)量,但是未達(dá)顯著差異。黃芩苷濃度在50和100μg/m L時(shí)可極顯著地(P0.01)抑制IL-18 m RNA的表達(dá),濃度25μg/m L時(shí)顯著地(P0.05)下調(diào)IL-18 m RNA的表達(dá)量。④脂多糖誘導(dǎo)3h和6h后,中晚期凋亡的仔豬外周血單核細(xì)胞熒光強(qiáng)度值極顯著的增加(P0.01)。黃芩苷濃度在12.5、25、50和100μg/m L時(shí)均能夠極顯著地(P0.01)降低中晚期凋亡細(xì)胞的數(shù)量及密度,緩解細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。⑤脂多糖誘導(dǎo)10h后,仔豬外周血單核細(xì)胞中Cleaved Caspase-1 p20的蛋白表達(dá)量極顯著增加(P0.01)。黃芩苷濃度在25、50和100μg/m L時(shí)均能夠極顯著地(P0.01)抑制Cleaved Caspase-1 p20蛋白表達(dá)。以上結(jié)果表明,黃芩苷能緩解由脂多糖誘導(dǎo)引起的仔豬外周血單核細(xì)胞的炎癥反應(yīng),其作用與抑制NF-κB信號通路和NLRP3信號通路有關(guān)。
[Abstract]:The effect of baicalin on the immune stress of peripheral blood mononuclear cells in piglets was established by studying the effects of baicalin on the immune stress of peripheral blood mononuclear cells in piglets . The levels of TNF - 偽 and IL - 6 in peripheral blood mononuclear cells of piglets were significantly increased ( P0.01 ) .

【學(xué)位授予單位】：武漢輕工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1468180