本文關(guān)鍵詞： 鴨疫里默氏菌 基因缺失 Wza 莢膜 毒力　出處：《四川農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：利用生物信息學(xué)分析軟件初步確定鴨疫里默氏菌基因組中存在莢膜多糖輸出基因簇及其具有多糖輸出功能的wza基因,構(gòu)建wza基因缺失株,初步驗(yàn)證wza基因在鴨疫里默氏菌在致病性、生物膜形成、抗生素抗性、抗血清殺傷作用、細(xì)胞黏附與入侵以及莢膜形成等生物學(xué)特征中所發(fā)揮的作用,主要結(jié)果如下：1 wza基因的生物信息學(xué)分析wza基因全長(zhǎng)為726 bp,在其開放閱讀框上游11 bp處具有典型TATA啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)。此外,在wza基因下游,具有調(diào)節(jié)莢膜多糖輸出的酪蛋白激酶wzc基因、多個(gè)莢膜多糖合成相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶基因以及脂質(zhì)合成相關(guān)基因。該基因所編碼的Wza蛋白由241個(gè)氨基酸組成、分子量約26.6KD。經(jīng)過氨基酸序列比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)Wza蛋白與黃桿菌科細(xì)菌的多糖轉(zhuǎn)運(yùn)子具有較高相似性。保守功能域搜索發(fā)現(xiàn),該蛋白具有Poly_export family功能域,其主要功能是負(fù)責(zé)多糖的輸出。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其為一個(gè)外膜蛋白中的莢膜多糖輸出外膜蛋白Wza。Wza蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要組成成分為：α螺旋(23.24%)、延伸鏈(30.29%)、β折疊(14.11%)以及無規(guī)則卷曲(32.37%)。最后,使用同源建模的方法,使用SWTSS-MODEL程序構(gòu)律了鴨疫早默氏菌Wza蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。2鴨疫里默氏菌CH-1Δwza缺失株的構(gòu)建本次缺失株的構(gòu)建：利用自殺質(zhì)粒pYA4278通過同源重組的方法將wza基因的開放閱讀框中的704 bp敲掉。采用重疊PCR技術(shù)構(gòu)建wza基因左臂、右臂、spc三片段的融合PCR片段Awza-spc。自殺質(zhì)粒pYA4278經(jīng)AdhI酶切后具有T克隆載體的T粘性末端特征,本文直接將Awza-spc融合片段克隆到pYA4278上構(gòu)建了pYA4278-Δwza-spc重組自殺質(zhì)粒。將含有pYA4278-Δwza-spc的大腸桿菌X7123與鴨疫里默氏菌CH-1株進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移,篩選獲得CH-1Δwza缺失株并經(jīng)PCR鑒定正確。3鴨疫里默氏菌wza基因的部分功能初探wza基因的缺失導(dǎo)致鴨疫里默氏菌的生長(zhǎng)減慢,其菌落特征基本無變化。使用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),缺失株的莢膜明顯變薄。結(jié)晶紫染色分析發(fā)現(xiàn)鴨疫里默氏菌CH-1是一株典型的生物膜缺陷株,其OD595僅為0.049；而CH-1 Δwza的生物膜形成能力卻明顯的增加,其OD595為0.269。莢膜主要成分是莢膜多糖,其具有很強(qiáng)的親水性效果和抗氧化能力。通過抗干燥試驗(yàn)以及抗氧化試驗(yàn)的結(jié)果可以看出,缺少莢膜保護(hù)的CH-1 Δwza在干燥環(huán)境或者低濃度的雙氧水條件下的存活率遠(yuǎn)低于親本株。此外,表面疏水性試驗(yàn)結(jié)果顯示缺失株的疏水性顯著升高。選擇常用的抗生素藥敏紙片檢測(cè)CH-1 Δwza和其親本株的對(duì)抗生素的敏感性的差異,與親本株相比,CH-1 Δwza對(duì)大部分抗生素的敏感性有明顯提高,表明鴨疫里默氏菌莢膜多糖的莢膜與抗生素的抗性存在聯(lián)系：其莢膜與多種細(xì)菌一樣,是抵抗抗生素的天然保護(hù)屏障。補(bǔ)體殺傷試驗(yàn)表明親本株在90%血清濃度下的存活率大約為85%,而缺失株的存活率為0。說明wza基因在鴨疫里默氏菌侵染宿主以及引起敗血癥方面發(fā)揮著巨大作用。4.Wza是鴨疫里默氏菌的一個(gè)毒力因子細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附和入侵是細(xì)菌感染宿主的先決條件,而wza基因的缺失致使鴨疫里默氏菌細(xì)胞黏附力下降,數(shù)據(jù)顯示CH-1 Δwza和親本株在黏附試驗(yàn)中的黏附菌落數(shù)分別為5.8×104 CFU/孔和3.6x104CFU/孔。此外,通過測(cè)定CH-1 Δwza與親本株的LD50,發(fā)現(xiàn)親本株的LD50為5.62×107CFU/mL,而缺失株CH-1△wza的LD50為2.37x1010 CFU/mL。根據(jù)LD50值可以得出wza基因的缺失導(dǎo)致了鴨疫里默氏菌毒力下降了421倍。因此,wza基因與鴨疫里默氏菌的致病性具有一定的聯(lián)系。
[Abstract]:Using bioinformatics analysis identified Riemerella anatipestifer genomes in presence of capsular polysaccharide export gene cluster and Wza gene has a polysaccharide output function, the construction of Wza gene deletion strains, preliminary verification of Wza gene in Riemerella anatipestifer in pathogenicity, biofilm formation, antibiotic resistance, antiserum killing effect, play cell the adhesion and invasion as well as the capsule forming the biological characteristics of the role, the main results are as follows: 1 Wza gene bioinformatics analysis of Wza gene was 726 BP in the open reading frame of 11 bp upstream of typical TATA promoter binding sites. In addition, in the downstream of the Wza gene, with casein kinase WZC gene regulates capsular polysaccharide sugar output, a plurality of capsular polysaccharide synthesis related glycosyltransferase gene and lipid synthesis genes. The gene encoding the Wza protein consists of 241 amino acids, molecular The amount of about 26.6KD. by amino acid sequence analysis found that the polysaccharide transporter protein Wza and flavobacteriaceae bacteria have high similarity. Conserved domain search found that the protein has a Poly_export domain of family, its main function is to output for polysaccharide. Subcellular localization prediction showed that the two level structure of a membrane protein the output of the capsular polysaccharide outer membrane protein Wza.Wza protein as main component: the alpha helix (23.24%), extended chain (30.29%), (14.11%) and beta folding random coil (32.37%). Finally, using homology modeling method, using the SWTSS-MODEL program. The law construction of duck plague early Alzheimer's strain Wza protein the three level structure of.2 Riemerella anatipestifer CH-1 Delta Wza mutant to construct the mutant by homologous recombination with the Wza gene open reading frame of 704 BP knocked out by plasmid pYA4278. The Dutch act Construction of Wza gene PCR technology stack left arm, right arm, T sticky ends feature fusion fragment of PCR Awza-spc. SPC three Dutch act fragments of plasmid pYA4278 were digested with AdhI with T cloning vector, this paper will directly to pYA4278 to construct pYA4278- recombinant plasmid wza-spc Dutch act fusion Awza-spc fragment was cloned. PYA4278- containing a wza-spc of Escherichia coli X7123 with Riemerella anatipestifer strain CH-1 conjugation, missing part function of Wza gene CH-1 Delta Wza mutant was screened and identified by PCR.3 of Riemerella anatipestifer Wza gene leads to decreased growth of Riemerella anatipestifer, no change in the basic characteristics of colonies. TEM observation showed that the capsule deficient strains was thinner. Crystal violet staining analysis found that Riemerella anatipestifer CH-1 is a typical biofilm mutant, the OD595 is only 0.049; and the biofilm forming ability was CH-1 Wza Increased significantly, the OD595 as the main component of 0.269. capsule is capsular polysaccharide, which has hydrophilic effect and strong antioxidative capability. The anti drying test and antioxidant test results show that the survival rate of the lack of protection of the CH-1 Wza capsule in the double oxygen water dry environment or the low concentration of the far below the parental strain. In addition, the surface hydrophobicity test showed that hydrophobic deletion strains were significantly increased. Differences in antibiotic susceptibility test Wza CH-1 a commonly used and its parental strains of antibiotic sensitivity, compared with the parent strain, CH-1 Wza has significantly improved sensitivity to most antibiotics, indicate the presence of contact resistance the capsule and antibiotics of Riemerella anatipestifer capsular polysaccharide: the capsule with a variety of bacteria, is a natural protective barrier against antibiotics. The complement test showed that parental strain in the killing of 90% serum The concentration of the survival rate is about 85%, while the mutant survival rate was 0. in the Wza gene of Riemerella anatipestifer infection and septicemia play a huge role in.4.Wza is a bacterial virulence factor of Riemerella anatipestifer on host cell adhesion and invasion is a prerequisite for host bacterial infection. The deletion of Wza gene in Riemerella anatipestifer decreased cell adhesion, adhesion data show colonies strain in adhesion test in the CH-1 Delta Wza and 5.8 * 104 CFU/ lines and 3.6x104CFU/ holes respectively. In addition, through the determination of CH-1 Wza and parental strain LD50, found that parental strain LD50 was 5.62 * 107CFU/mL however, the mutant strain CH-1 LD50 2.37x1010 CFU/mL. Wza LD50 according to the missing values can be obtained in the Wza gene of Riemerella anatipestifer virulence decreased 421 times. Therefore, the pathogenicity and Wza gene of Riemerella anatipestifer has A certain connection.

【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.61

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本文編號(hào)：1462051