本文關(guān)鍵詞： 鴨瘟病毒 gB gC基因 序列分析 gB蛋白 單克隆抗體 膠體金檢測(cè)試紙條　出處：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：鴨瘟是由鴨瘟病毒引起的一種急性、敗血性傳染病,以頭頸腫脹、食道黏膜和泄殖腔黏膜出血、黃白色潰瘍,頭頸部皮下有黃白色膠凍樣滲出為特征。該病一旦發(fā)生,發(fā)病急、死亡快、死亡率高,對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)危害嚴(yán)重。免疫預(yù)防是控制鴨瘟的重要措施,但近年來(lái)不斷出現(xiàn)鴨瘟疫苗免疫效果不佳的情況,鴨瘟病毒是否發(fā)生變異,找出其中的原因至關(guān)重要�？焖僭\斷是控制鴨瘟的重要措施之一,目前已建立了PCR、ELISA、間接免疫熒光技術(shù)、微量中和試驗(yàn)等檢測(cè)鴨瘟的方法,但是這幾種檢測(cè)方法均需特殊的儀器設(shè)備,且耗時(shí)長(zhǎng),不適于在基層推廣應(yīng)用。因此,建立一種更加快速、靈敏的病毒檢測(cè)方法迫在眉睫。膠體金免疫層析技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的集膠體金標(biāo)記技術(shù)、蛋白層析技術(shù)于一體的新型快速免疫檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短,不需要特殊的儀器設(shè)備,特別適合在基層推廣應(yīng)用。單克隆抗體具有性質(zhì)均一穩(wěn)定、特異性高等特點(diǎn),可以作為病毒診斷方法的一個(gè)良好的工具。作為鴨瘟病毒的高度保守性蛋白之一,gB蛋白的免疫原性良好,高度的特異性和保守性決定了該蛋白能夠?yàn)榻⑿碌臋z測(cè)方法提供良好的材料。本研究通過(guò)對(duì)近幾年來(lái)從各地采集的鴨瘟病料,擴(kuò)增DPV主要基因gB gC基因并進(jìn)行測(cè)序比對(duì)分析,從分子水平上研究鴨瘟病毒變異情況。制備針對(duì)鴨瘟病毒gB蛋白的單克隆抗體,并利用制備的單抗,建立了膠體金試紙條檢測(cè)方法。本研究設(shè)計(jì)鴨瘟病毒gB gC基因的特異性引物,將近幾年來(lái)各地送檢疑似鴨瘟病料處理后,采用鴨胚尿囊膜接種法分離鴨瘟病毒,提取病毒DNA作為模板。PCR擴(kuò)增目的基因,連接于載體pMD-18T上,將PCR鑒定為陽(yáng)性的菌液測(cè)序,與NCBI上已發(fā)表的鴨瘟強(qiáng)毒株2085(序列號(hào):JF999965)及鴨瘟弱毒疫苗株VAC(序列號(hào):EU082088)序列進(jìn)行比對(duì),同時(shí)比對(duì)不同毒株之間的同源性。結(jié)果顯示,測(cè)序的9株鴨瘟病毒的同源性在99%~100%之間,表明鴨瘟病毒主要基因未發(fā)生變異。利用生物學(xué)軟件Protean分析,選擇鴨瘟病毒抗原表位較多的一段序列設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增目的基因。連接到載體pMD-18T上,測(cè)序正確后再連接到原核表達(dá)載體pET-28a上。將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)的蛋白經(jīng)純化后測(cè)其濃度并經(jīng)western blot鑒定分析。以表達(dá)的DPV-gB蛋白作為抗原,免疫7周齡BALB/c小鼠,取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合,經(jīng)間接ELISA篩選及亞克隆,共獲得4株能穩(wěn)定分泌抗DPV-gB蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為A8D7、E6C3、H11F8、H6F6。間接ELISA檢測(cè)腹水效價(jià)分別為1:103、1:103、1:105、1:103。亞類鑒定結(jié)果分別為IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1,輕鏈均為kappa鏈。Western blot結(jié)果顯示4株單抗均能與DPV-gB蛋白特異性結(jié)合。IFA結(jié)果顯示制備的4株單抗是針對(duì)DPV產(chǎn)生的。在獲得DPV-gB特異性單克隆抗體的基礎(chǔ)上,采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒,以制備的H6F6單抗作為標(biāo)記抗體(標(biāo)記的最適pH值為8.0~8.5,最佳標(biāo)記濃度為15倍原液稀釋),將純化的A8D7單抗(濃度為2倍原液稀釋)和羊抗鼠IgG(濃度為10倍稀釋)包被在硝酸纖維素膜(NC)上,分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線,經(jīng)條件優(yōu)化建立了鴨瘟病毒膠體金試紙條檢測(cè)方法。檢測(cè)結(jié)果顯示:該試紙條能夠特異地檢測(cè)鴨瘟病毒,與DRV、EDS-76V、AIV-H9N2、TMUV均無(wú)交叉反應(yīng);陽(yáng)性尿囊液稀釋50倍后用該試紙條檢測(cè)依然為陽(yáng)性;用不同批次的試紙條重復(fù)檢測(cè),結(jié)果無(wú)差異;利用制備的膠體金試紙條和PCR方法對(duì)38份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)比較,結(jié)果顯示兩者符合率為91.6%。所制備的試紙條具有良好的特異性、敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性,便于DPV的快速診斷和檢測(cè)。
[Abstract]:This paper presents a new rapid and sensitive method for detecting duck plague , which is one of the important measures to control duck plague . The results showed that the purified A8D7 monoclonal antibody was used as antigen , and then it was cloned into prokaryotic expression vector pET - 28a . The results showed that 4 strains of duck plague virus could be used as the antigen , and then it was cloned into prokaryotic expression vector pET - 28a .

【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S855.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 郭宇飛;程安春;汪銘書(shū);賈仁勇;文明;周偉光;周毅;陳孝躍;;鴨胚成纖維細(xì)胞中鴨瘟強(qiáng)毒的增殖特性研究[J];病毒學(xué)報(bào);2008年05期

2 姜龍;劉會(huì)娟;程安春;汪銘書(shū);陳正禮;賈仁勇;朱德康;陳孝躍;;皰疹病毒gB基因及其編碼蛋白研究進(jìn)展[J];病毒學(xué)報(bào);2010年05期

3 齊雪峰,羅薇,楊曉燕;應(yīng)用ELISA檢測(cè)鴨瘟抗體的研究[J];現(xiàn)代畜牧獸醫(yī);2004年12期

4 李云飛;邢海紅;馮曉東;黃素珍;;免疫膠體金技術(shù)在獸醫(yī)檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J];上海畜牧獸醫(yī)通訊;2009年06期

5 趙軍;楊孝樸;宋曉育;;鴨瘟病毒的免疫學(xué)研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通報(bào);2014年07期

6 胡思順;鄭興華;蔡開(kāi)妹;彭伏虎;張文澤;李自力;肖運(yùn)才;劉梅;畢丁仁;;禽流感病毒感染與疫苗免疫鑒別診斷試紙條的研制及應(yīng)用[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年02期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 辛敬凱;B亞群禽白血病病毒單克隆抗體的制備[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

，

本文編號(hào)：1461641