本文關(guān)鍵詞：弓形蟲發(fā)育期特異雙熒光指示株及MIC3基因敲除株的構(gòu)建

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【摘要】：剛地弓形蟲是一種專性寄生于的有核細(xì)胞內(nèi)的寄生原蟲,屬于頂復(fù)門球蟲綱,一旦感染會(huì)引起人獸共患弓形蟲病。弓形蟲以生活史復(fù)雜,感染宿主廣泛聞名于世,幾乎所有溫血?jiǎng)游锇ㄈ祟愒趦?nèi)均可作為其中間宿主,被譽(yù)為最成功的寄生原蟲。本研究構(gòu)建兩種弓形蟲突變株,分別為從蟲體的轉(zhuǎn)化和入侵兩方面研究提供一定幫助。(1)弓形蟲速殖子緩殖子雙熒光突變株的構(gòu)建每當(dāng)弓形蟲速殖子首次入侵宿主時(shí),通常導(dǎo)致急性感染,若處理不當(dāng)產(chǎn)生嚴(yán)重并發(fā)癥甚至死亡。而通常在免疫系統(tǒng)以及藥物作用下,速殖子會(huì)逐漸轉(zhuǎn)化為緩殖子,緩殖子聚集形成包囊,進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿腥�。慢性感染一般不呈現(xiàn)任何臨床癥狀。而一旦宿主免疫系統(tǒng)減弱或抑制時(shí),例如艾滋病和器官移植造成的免疫抑制時(shí),緩殖子會(huì)重新轉(zhuǎn)化為速殖子,重新引發(fā)急性感染癥狀。這種速殖子和緩殖子之間的相互轉(zhuǎn)化導(dǎo)致了弓形蟲病最大特點(diǎn):機(jī)會(huì)致病性。但是對(duì)其轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制目前還不清楚。速殖子和緩殖子雖然是蟲體的兩種階段,但在形態(tài)學(xué)上區(qū)別并不明顯,肉眼不易區(qū)分。雖然緩殖子形成的包囊觀察起來(lái)非常明顯,但無(wú)法明確觀察到速殖子與緩殖子間轉(zhuǎn)化的過程,因此迫切需要一種較方便觀察速殖子緩殖子間體外轉(zhuǎn)化的平臺(tái)。隨著當(dāng)前弓形蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)和弓形蟲熒光蛋白技術(shù)應(yīng)用及發(fā)展,用不同熒光蛋白標(biāo)記速殖子與緩殖子,使我們能更好的觀察速殖子緩殖子在體外的轉(zhuǎn)化(張彥雷等2011)。本研究選取速殖子期和緩殖子期特異的兩個(gè)基因SAG1和BAG1,以及兩個(gè)時(shí)期共有基因GRA2。通過在NCBI和弓形蟲基因數(shù)據(jù)庫(kù)上檢索分析,確定了SAG1和BAG1的啟動(dòng)子序列,以及GRA2的終止子序列,設(shè)計(jì)引物通過PCR從弓形蟲基因組中獲得這3段序列。然后通過overlap PCR,酶切等方法,使SAG1p后面連上綠熒光蛋白基因GFP和GRA2t;BAG1p后面連上紅熒光蛋白R(shí)FP和GRA2t,并將連入同一個(gè)真核轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1(+),并添加一個(gè)藥物篩選標(biāo)記DHFR。之后通過電轉(zhuǎn)化將該質(zhì)粒導(dǎo)入弓形蟲RH株,在通過體外藥物培養(yǎng)獲得了速殖子期發(fā)綠光的弓形蟲。隨后多次進(jìn)行堿性誘導(dǎo)處理,嘗試觀察紅熒光未果。本實(shí)驗(yàn)成功獲得重組質(zhì)粒,為后續(xù)構(gòu)建雙熒光蟲體積累經(jīng)驗(yàn),且該熒光蟲體能在體外培養(yǎng)中較容易的觀察弓形蟲速殖子與緩殖子的轉(zhuǎn)化,能為研究速殖子和緩殖子相互轉(zhuǎn)化的過程提供較便利的平臺(tái),也能為抗弓形蟲新藥的研究提供較方便的工具。(2)弓形蟲微線體蛋白3敲除株的構(gòu)建弓形蟲之所以能感染如此眾多的宿主,成功的入侵機(jī)制是關(guān)鍵所在。而在入侵宿主細(xì)胞的過程中頂端黏附是必不可少的階段,在此階段中,蟲體分泌微線體蛋白(MIC)與宿主細(xì)胞表面蛋白或糖類進(jìn)行相互作用,介導(dǎo)蟲體的頂端和宿主細(xì)胞進(jìn)行定向的黏附�？梢娢⒕�體蛋白(MIC)對(duì)蟲體致病性有著重要影響。本研究選擇敲除MIC家族中的MIC3基因,該基因編碼的分泌蛋白形成二聚體,介導(dǎo)蟲體與宿主細(xì)胞的結(jié)合。利用CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)構(gòu)建了兩個(gè)質(zhì)粒:MIC3敲除質(zhì)粒和DHFR同源整合質(zhì)粒,然后在根據(jù)基因組中MIC3序列上游、中間、下游序列設(shè)計(jì)了3個(gè)PCR反應(yīng)來(lái)檢測(cè)敲除的正確性。通過藥物篩選傳代培養(yǎng),成功得到了MIC3基因缺失弓形蟲株。然后利用該蟲株進(jìn)行了生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn),噬斑實(shí)驗(yàn)和毒力實(shí)驗(yàn)等,對(duì)當(dāng)MIC3基因缺失蟲體在生長(zhǎng),形態(tài),毒力等各種方面的變化進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)當(dāng)MIC基因3敲除后,蟲體活力不但沒有減弱相反促進(jìn)其在細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)產(chǎn),并且對(duì)小鼠的毒力增強(qiáng)。這些變化為進(jìn)一步揭示MIC3基因的機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為后續(xù)研究MIC3基因?qū)蜗x生理意義提供一定的理論依據(jù)。同時(shí)證明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在弓形蟲的基因敲除技術(shù)中也日臻成熟,為今后對(duì)弓形蟲其它基因敲除修飾提供了幫助。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.7

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