本文關(guān)鍵詞：豬呼吸道疾病綜合征六種病原基因芯片檢測(cè)方法的建立

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【摘要】：豬呼吸道疾病綜合征(Porcine respiratory disease complex,PRDC)是由病毒、細(xì)菌、支原體、寄生蟲(chóng)及環(huán)境應(yīng)激等多種因素引起,以呼吸困難、咳嗽、發(fā)熱、生長(zhǎng)遲緩等為臨床特征的一類豬常見(jiàn)疾病。病原學(xué)分析發(fā)現(xiàn),引起PRDC的主要病原包括豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)、豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV-2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、豬流感病毒(Swine influenza virus,SIV)等,其中APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV及CSFV六種病原在我國(guó)較為常見(jiàn),規(guī)�；B(yǎng)豬中多病原的混合感染或繼發(fā)感染大大增加了臨床診斷的難度。目前,對(duì)APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV和CSFV六種病原的檢測(cè)多進(jìn)行單一病原的分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)、PCR擴(kuò)增等,缺少可同步鑒別檢測(cè)六種病原的方法。因此,建立一種可同時(shí)檢測(cè)PRDC六種重要病原的方法,節(jié)省成本,提高檢測(cè)效率,對(duì)豬病的流行病學(xué)調(diào)查、疫病監(jiān)控、進(jìn)出境檢疫等具有重要意義。本研究以APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV及CSFV作為研究對(duì)象,建立了可同步鑒別檢測(cè)六種病原的基因芯片,該方法具有較好的特異性和穩(wěn)定性。其主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:1.引物和探針的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中登錄的APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV及CSFV的基因序列,使用生物學(xué)軟件Mega5、Primer Premier 5.0和Oligo 6.0進(jìn)行分析比對(duì)、設(shè)計(jì)6對(duì)特異性引物和多條探針。對(duì)六種病原核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增,構(gòu)建T-克隆載體,基于電泳檢測(cè)和測(cè)序比對(duì)結(jié)果篩選陽(yáng)性質(zhì)粒。2.探針篩選和單一病原基因芯片檢測(cè)方法的建立參考GeXP的標(biāo)記方法,對(duì)靶序列進(jìn)行Cy3熒光標(biāo)記,與固定于醛基基片表面的探針進(jìn)行避光雜交,掃描雜交結(jié)果,篩選特異性高且熒光信號(hào)強(qiáng)的探針。在探針篩選的基礎(chǔ)上,進(jìn)行退火溫度、外循環(huán)次數(shù)、雜交探針濃度、雜交液、雜交溫度和雜交時(shí)間的優(yōu)化,確定退火溫度為56~58℃和外循環(huán)25~30次進(jìn)行擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物與自配雜交液混合,42℃避光雜交3h。對(duì)單一病原基因芯片檢測(cè)方法的特異性、敏感性、穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估,結(jié)果顯示:該方法具有較好的特異性和穩(wěn)定性,其中敏感性分別為APP 2.97×102拷貝/μL、HPS 4.38×103拷貝/μL、Mhp 8.26×102拷貝/μL、PCV-2 3.78×102拷貝/μL、PRRSV 1.38×103拷貝/μL、CSFV 3.32×10拷貝/μL。該方法的檢測(cè)敏感性與普通PCR擴(kuò)增相比高10~100倍。3.六種病原基因芯片單管同步檢測(cè)方法的建立和初步應(yīng)用在單一病原基因芯片檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上,通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化六種病原特異性嵌合引物的濃度,初步建立六種病原同步檢測(cè)的基因芯片方法。優(yōu)化雜交溫度和時(shí)間,進(jìn)行方法評(píng)估。特異性試驗(yàn):對(duì)偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒、日本乙型腦炎病毒、豬水皰病病毒、水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、藍(lán)舌病病毒、小反芻獸疫病毒和沙門(mén)氏菌的核酸進(jìn)行擴(kuò)增雜交,驗(yàn)證構(gòu)建芯片的特異性。結(jié)果顯示,該方法與上述病原均無(wú)交叉反應(yīng)。敏感性試驗(yàn):將六種病原的陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行混合后倍比稀釋,以其為模板進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。結(jié)果顯示:APP 5.8×102拷貝/μL、HPS 7.8×103拷貝/μL、Mhp 6.8×103拷貝/μL、PCV-2 6.3×102拷貝/μL、PRRSV 4.8×103拷貝/μL、CSFV 5.5×102拷貝/μL。因此,綜合考慮六種病原的檢出限,多病原單管同步檢測(cè)基因芯片的敏感性為103拷貝/μL。重復(fù)性試驗(yàn):選取同一批次制備的6張基片和不同批次制備的6張基片,進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示:組內(nèi)組間試驗(yàn)均具有較高的可重復(fù)性。保存期試驗(yàn):本試驗(yàn)進(jìn)行了為期4個(gè)月的保存期試驗(yàn),確定芯片的最優(yōu)保存條件。結(jié)果顯示:該方法制備的芯片至少可在-20℃條件下保存4個(gè)月。臨床初步應(yīng)用:對(duì)重慶地區(qū)采集的186份樣品分別使用本研究建立方法與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行對(duì)比分析,結(jié)果顯示:基因芯片方法檢出單一病原感染34份,多病原混合感染11份;現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法檢出單一病原感染28份,多病原混合感染13份。將兩種方法檢出的陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)序分析,測(cè)序結(jié)果與基因芯片方法檢出結(jié)果一致,說(shuō)明基因芯片方法可用于多種病原的臨床鑒別檢測(cè)。本研究建立了一種可同步鑒別檢測(cè)APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV及CSFV六種重要病原的基因芯片方法,為基因芯片在動(dòng)物疫病中的研究和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ),也為PRDC病原的鑒別檢測(cè)提供技術(shù)支撐。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.28

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中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 楊林;潘全會(huì);曹巧玲;張桂紅;陳蘇紅;廖明;;豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒基因芯片檢測(cè)技術(shù)的建立與優(yōu)化[J];中國(guó)動(dòng)物檢疫;2007年05期

2 謝明星;彭小莉;苗春柳;劉棠;陳偉玲;王群力;王景明;周斌華;徐維佳;許秋貝;;牛白細(xì)胞黏附缺陷病液相基因芯片檢測(cè)方法的建立[J];中國(guó)奶牛;2013年17期

3 徐超;李苗云;馮松凱;;皮毛中5種病毒基因芯片檢測(cè)方法的研究[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2013年04期

4 陳潔,陶悅,鄭敏,劉建華;應(yīng)用固相聚合酶延伸反應(yīng)的基因芯片檢測(cè)技術(shù)[J];上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2002年04期

5 馮松凱;李苗云;徐超;張勤;苗麗;李珂;楊娜;劉勝男;呂曉飛;;毛皮中6種致病菌基因芯片檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2013年05期

6 楊若松;姜金慶;張志;李曉成;王建華;任夫波;張麗麗;;4種豬群常見(jiàn)病毒基因芯片檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2012年03期

7 ;[J];;年期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 翟俊輝;宋亞軍;杜宗敏;郭兆彪;王津;楊瑞馥;;臨床常見(jiàn)感染性細(xì)菌通用基因芯片檢測(cè)方法的研究[A];新世紀(jì)預(yù)防醫(yī)學(xué)面臨的挑戰(zhàn)——中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)首屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2002年

2 顧大勇;魯衛(wèi)平;王華;石磊;周元國(guó);;納米金基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)合通用引物一次PCR法檢測(cè)病原性細(xì)菌的研究[A];第四屆全國(guó)臨床檢驗(yàn)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

3 曹新民;趙偉;劉偉;;肝硬化肝組織中HBVDNA基因芯片檢測(cè)探討[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)全國(guó)第九次感染病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

4 梁念慈;莫麗兒;覃燕梅;何太平;;用腫瘤基因芯片檢測(cè)大黃素對(duì)HO-8910PM細(xì)胞基因表達(dá)的影響[A];第十屆全國(guó)生化與分子藥理學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2007年

5 冀子中;;基因芯片檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌感染患者IL-1β基因多態(tài)性[A];2013第六屆浙江省消化病學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2013年

6 顧大勇;魯衛(wèi)平;王華;石磊;周元國(guó);;納米金基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)合通用引物一次PCR法檢測(cè)病原性細(xì)菌的研究[A];第五次全國(guó)中青年檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

7 趙錦;鄧平建;劉建軍;房師松;黃自然;;轉(zhuǎn)基因食品基因芯片檢測(cè)技術(shù)的研究[A];新世紀(jì)預(yù)防醫(yī)學(xué)面臨的挑戰(zhàn)——中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)首屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2002年

8 宣世海;;酶顯色法基因芯片檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌克拉霉素耐藥基因[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第八次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)分會(huì)成立30周年慶典大會(huì)資料匯編[C];2009年

9 吳文苑;段朝暉;方紅輝;唐曙明;劉艾芹;;高危型人乳頭瘤病毒感染及基因型分析[A];全國(guó)臨床免疫檢驗(yàn)研討會(huì)暨第六屆全國(guó)臨床免疫學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

10 劉申;劉智勇;黃慶;徐婷;王貴宇;府偉靈;;基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)在分枝桿菌鑒定及耐藥性分析的臨床應(yīng)用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第九次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨中國(guó)醫(yī)院協(xié)會(huì)臨床檢驗(yàn)管理專業(yè)委員會(huì)第六屆全國(guó)臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 記者 劉肖勇;基因芯片檢測(cè)可預(yù)防“一針致聾”[N];廣東科技報(bào);2010年

2 陳飛;諾如等食源性病毒可用基因芯片檢測(cè)[N];健康報(bào);2007年

3 記者 劉麗 通訊員 袁立新;基因芯片檢測(cè)乙肝病毒[N];南方日?qǐng)?bào);2004年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 顧大勇;納米金新型基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)的優(yōu)化研究及其在臨床病原微生物快速檢測(cè)中的應(yīng)用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

2 金玉姬;男性人乳頭瘤病毒基因芯片檢測(cè)方法的建立及臨床應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2008年

3 阮標(biāo);RT-PCR檢測(cè)血中IL-1β、IL-6預(yù)測(cè)診斷大鼠創(chuàng)傷性深靜脈血栓相關(guān)性研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2009年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 保雨;豬呼吸道疾病綜合征六種病原基因芯片檢測(cè)方法的建立[D];西南大學(xué);2016年

2 曹佳媛;三種病毒性出血熱熒光與可視化基因芯片檢測(cè)方法的建立[D];廣西大學(xué);2016年

3 趙渝徽;壓電石英晶體傳感器產(chǎn)氣莢膜梭菌基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2007年

4 朱曉光;主要蟲(chóng)媒病毒基因芯片檢測(cè)方法的建立[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2007年

5 曾婷;CYP450亞洲人群熱點(diǎn)突變基因芯片檢測(cè)試劑盒的研制[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2008年

6 朱瑞豪;雞三種免疫抑制病基因芯片檢測(cè)方法的建立[D];河南科技學(xué)院;2015年

7 吳曉巍;玉米檢疫性種傳細(xì)菌免疫學(xué)及基因芯片檢測(cè)方法的研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

8 韓霄;基因芯片檢測(cè)HearNPV基因組轉(zhuǎn)錄譜[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（武漢病毒研究所）;2007年

9 程克斌;基因芯片檢測(cè)肺栓塞—深靜脈血栓形成相關(guān)基因群的研究[D];同濟(jì)大學(xué);2006年

10 王柯;UC惡性轉(zhuǎn)化中MDSC的誘導(dǎo)與作用機(jī)制研究[D];中南大學(xué);2013年

，

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