本文關(guān)鍵詞：影響牛病毒性腹瀉病毒復(fù)制的miRNAs的篩選及功能研究

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【摘要】：牛病毒性腹瀉/黏膜病(bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD-MD)是由牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的接觸性傳染病,在全球分布廣泛,危害嚴(yán)重。關(guān)于BVDV導(dǎo)致的持續(xù)性感染和免疫抑制發(fā)生的分子機(jī)制,尤其是BVDV與宿主細(xì)胞之間相互作用關(guān)系尚沒有系統(tǒng)性的闡述。mi RNAs是生物體內(nèi)在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵分子,由于其途徑的專一性強(qiáng)以及效果明顯等特點(diǎn),mi RNAs及其靶位點(diǎn)已經(jīng)成為治療病毒性疾病的特效基因藥物設(shè)計(jì)的新亮點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室高通量測(cè)序檢測(cè)了BVDV感染靶細(xì)胞MDBK后的mi RNAs差異表達(dá)譜顯示:23個(gè)mi RNAs的表達(dá)量顯著性升高;而通過生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)得到三個(gè)靶向BVDV NADL全基因組的mi RNAs,所以本研究以篩選出來的影響B(tài)VDV復(fù)制的mi RNAs為研究對(duì)象,探究mi RNAs影響B(tài)VDV-NADL復(fù)制的分子機(jī)制,進(jìn)而為闡述BVDV的持續(xù)性感染的分子機(jī)制,BVDV防控新方法奠定理論基礎(chǔ)。[目的]本研究以BVDV NADL為研究對(duì)象,根據(jù)BVDV NADL感染宿主細(xì)胞MDBK后mi RNAs的差異探索mi RNAs影響B(tài)VDV NADL復(fù)制的分子機(jī)制。(1)探究bta-mi R-33a靶向MDBK細(xì)胞中BCL凋亡通路中bim(Bcl-2 interacting mediator of cell death)基因從而影響B(tài)VDV NADL復(fù)制的機(jī)制;(2)探究bta-mi R-302c靶向BVDV NADL NS5A基因從而影響B(tài)VDV NADL復(fù)制的機(jī)制;[方法](1)依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期高通量測(cè)序結(jié)果篩選合成22個(gè)mi RNAs,轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞后感染BVDV NADL,篩選出抑制BVDV NADL復(fù)制的mi RNAs;q RT-PCR擴(kuò)增BVDV NADL E0基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線;(2)生物學(xué)信息軟件預(yù)測(cè)bta-mi R-33a的靶基因并用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證;q RT-PCR、Western blot、流式細(xì)胞儀等方法檢測(cè)bta-mi R-33a的靶基因bim蛋白的表達(dá)水平及凋亡率的變化;q RT-PCR檢測(cè)bta-mi R-33a對(duì)BVDV NADL拷貝數(shù)的影響;構(gòu)建帶有綠色熒光蛋白標(biāo)記的bim基因過表達(dá)慢病毒載體;q RT-PCR、Western blot、流式細(xì)胞儀等方法檢測(cè)MDBK過表達(dá)bim基因后bta-mi R-33a的靶基因bim蛋白的表達(dá)水平及凋亡率的變化;q RT-PCR檢測(cè)MDBK細(xì)胞過表達(dá)bim基因后bta-mi R-33a對(duì)BVDV NADL拷貝數(shù)的影響;(3)生物學(xué)信息軟件預(yù)測(cè)靶向BVDV NADL全基因組的mi RNAs并用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證;q RT-PCR檢測(cè)bta-mi R-302c、bta-mi R-205、bta-mi R-497對(duì)BVDV NADL拷貝數(shù)和對(duì)TCID50的影響;q RT-PCR、Western blot檢測(cè)感染BVDV NADL不同時(shí)間段后MDBK細(xì)胞中JAK-STAT通路中各個(gè)因子的表達(dá)水平變化;q RT-PCR、Western blot檢測(cè)BVDV NADL感染和/或bta-mi R-302c轉(zhuǎn)染不同時(shí)間段后,MDBK細(xì)胞中JAK-STAT通路中各個(gè)因子的表達(dá)水平變化。[結(jié)果](1)bta-mi R-33a、bta-mi R-27a-5p、bta-mi R-21*可以顯著的降低BVDVNADL的復(fù)制水平;成功構(gòu)建BVDV NADL E0基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線;(2)bta-mi R-33a特異性靶向MDBK細(xì)胞中凋亡通路中bim基因3’非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR);bta-mi R-33a通過沉默bim基因的表達(dá)降低MDBK的凋亡率;bta-mi R-33a通過靶向bim基因降低BVDV NADL的拷貝數(shù);成功構(gòu)建過表達(dá)bim的慢病毒;bta-mi R-33a轉(zhuǎn)染下調(diào)bim基因過表達(dá)的MDBK細(xì)胞中的bim蛋白表達(dá)水平;bta-mi R-33a能特異性降低bim基因過表達(dá)的MDBK細(xì)胞中BVDV NADL的拷貝數(shù);(3)bta-mi R-302c特異性的靶向BVDV NADL的NS5A 3’端;bta-mi R-302c和bta-mi R-205下調(diào)BVDV NADL E0的m RNA水平,bta-mi R-497上調(diào)BVDV NADL E0的m RNA水平;隨著感染BVDV NADL的時(shí)間的增長,JAK-STAT通路中各個(gè)因子的表達(dá)水平逐漸升高;bta-mi R-302c抑制JAK-STAT通路中各個(gè)因子的表達(dá)水平;[結(jié)論]:bta-mi R-33a負(fù)向調(diào)控細(xì)胞凋亡通路中Bcl-2-L11蛋白家族中的bim蛋白,抑制MDBK細(xì)胞凋亡,使BVDV不能擴(kuò)散,從而抑制了BVDV的復(fù)制;bta-mi R-302c靶向BVDV NADL NS5A的3’端,間接地調(diào)控JAK-STAT通路,誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白,激發(fā)抗病毒機(jī)制,抑制BVDV NADL復(fù)制。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
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本文編號(hào)：1153636