本文關鍵詞：奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)及干細胞鑒定

  更多相關文章： 奶牛 乳腺上皮細胞 干/祖細胞 標記滯留 泌乳

【摘要】：奶牛乳腺上皮細胞(dairy cow mammary epithelial cells,DCMECs)作為常用的體外實驗工具,為奶牛乳腺發(fā)育、泌乳調(diào)控及乳腺生物反應器等方面的研究提供細胞模型。目前,DCMECs永生化細胞系的建立尚未成熟,需要在體外誘導并模擬生理條件,通過原代培養(yǎng)來獲得具有泌乳功能的分泌性乳腺上皮細胞或構(gòu)建三維立體的腺泡模型。乳腺是出生后發(fā)育的器官,青春期首次快速發(fā)育及妊娠期再次發(fā)育都與乳腺干細胞(mammary stem cells,MaSCs)活躍的自我更新及分化密切相關。研究表明乳腺中存在一定比例的干細胞,但區(qū)分鑒定這些多潛能干細胞的特異性分子標志仍不十分明確。一些激素及生長因子類物質(zhì)在體內(nèi)能夠促進乳腺發(fā)育、調(diào)控泌乳,在體外能夠促進乳腺上皮細胞增殖,影響細胞黏附、遷移、伸展和分化,并且涉及到對MaSCs的調(diào)控。激素和生長因子如何影響MaSCs擴增、分化并維持其多能性,以及調(diào)控乳腺上皮細胞生長、分化參與體外立體腺泡構(gòu)建的機制值得深入研究。本研究以原代培養(yǎng)的DCMECs為實驗模型,探討短期內(nèi)獲得大量DCMECs的方法,篩選乳腺上皮干細胞新型分子標志,鑒定奶牛乳腺上皮干細胞,觀察黃苷及IGF-Ⅰ對乳腺上皮細胞及乳腺上皮干細胞的影響。實驗中采用膠原酶消化法體外培養(yǎng)DCMECs,通過繪制細胞生長曲線、核型分析、Western Blotting檢測酪蛋白、熒光定量PCR檢測泌乳相關基因等實驗技術(shù)與方法評估原代(或傳代)細胞的生長活性與泌乳潛能;利用激光共聚焦顯微技術(shù)進行免疫熒光觀察與分析,根據(jù)乳腺上皮干細胞分子標志表達、Brd U標記滯留的特點以及細胞分裂方式鑒定原代乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)體系中的乳腺上皮干細胞。結(jié)果表明:(1)主要成分為膠原酶Ⅳ、透明質(zhì)酸酶、DNA酶Ⅰ的消化液混合物在3h內(nèi)高效率消化組織塊,得到的原代及傳代細胞是具有60條染色體,呈現(xiàn)典型上皮細胞形態(tài),CK18表達陽性,生長活力旺盛,能夠合成分泌β-casein的正常DCMECs,可作為后期實驗材料。(2)在體外培養(yǎng)過程中,通過實時熒光定量PCR方法檢測分析P0、P3、P6、P9細胞中催乳素、生長激素和胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)及其受體基因的表達變化,經(jīng)過比較分析發(fā)現(xiàn)原代與傳代后細胞在激素、生長因子及其受體mRNA水平上差異極顯著降低(P0.01)。表明在非誘導泌乳分化培養(yǎng)條件下,脫離泌乳生理環(huán)境的DCMECs自身具有的泌乳調(diào)控基因表達迅速受到抑制。(3)本研究根據(jù)成體干細胞具有Brd U標記滯留的特點檢測DCMECs中疑似乳腺干/祖細胞,同時分析兩種新發(fā)現(xiàn)的MaSCs分子標志(FNDC3B和PROCR)的表達定位,驗證應用它們指示乳腺上皮干細胞的可行性。結(jié)果顯示,連續(xù)培養(yǎng)25d后Brd U標記滯留上皮細胞(label-retaining epithelial cells,LRECs)比例接近0.4%,極少數(shù)細胞呈FNDC3B或PROCR陽性,可以觀察到不對稱分裂細胞,但在一定培養(yǎng)時間內(nèi),DCMECs群體中能夠保留一定比例疑似乳腺干/祖細胞,提示這些多能奶牛乳腺干/祖細胞在體外泌乳調(diào)控和乳腺腺泡重塑過程中可能發(fā)揮重要作用。(4)繪制細胞生長曲線,選擇對數(shù)生長期添加黃苷及IGF-Ⅰ,通過實時熒光定量PCR方法檢測分析原代及傳代細胞中催乳素、生長激素和IGF-Ⅰ及其受體的基因表達,以及干細胞分子標志FNDC3B和PROCR m RNA的表達變化。添加黃苷及IGF-Ⅰ后,P0-P9細胞PROCR mRNA的表達量顯著增高(P0.05),FNDC3B m RNA的表達量變化不顯著(P0.05),PRL/P RLR、GH/GHR、I GF-I/I GF-IR m RNA的相對表達量在P0-P3細胞中有升高趨勢而在P6-P9細胞中有下降趨勢,提示黃苷及IGF-Ⅰ對上皮細胞及干細胞的增殖有一定的促進作用,并對早期乳腺上皮細胞泌乳基因表達呈正調(diào)控。
【關鍵詞】：奶牛 乳腺上皮細胞 干/祖細胞 標記滯留 泌乳
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S823
【目錄】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 前言12-19
• 1.1 奶牛乳腺上皮細胞研究進展12-14
• 1.1.1 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀12-14
• 1.1.2 奶牛乳腺上皮細胞原代培養(yǎng)14
• 1.2 奶牛乳腺上皮干細胞研究進展14-18
• 1.2.1 干細胞14-15
• 1.2.2 乳腺上皮干細胞15-16
• 1.2.3 乳腺上皮干細胞的調(diào)控16-18
• 1.3 研究的目的與意義18-19
• 2 材料與方法19-28
• 2.1 實驗材料19
• 2.2 實驗儀器19-20
• 2.3 實驗試劑20-21
• 2.4 實驗方法21-27
• 2.4.1 原代奶牛乳腺上皮細胞分離培養(yǎng)與鑒定21-22
• 2.4.2 奶牛乳腺上皮干細胞的鑒定22-25
• 2.4.3 奶牛乳腺上皮細胞的生物學特性25-26
• 2.4.4 黃苷和IGF-Ⅰ對乳腺上皮干細胞標志分子和泌乳相關基因表達的調(diào)控26-27
• 2.5 數(shù)據(jù)處理27-28
• 3 結(jié)果與分析28-37
• 3.1 奶牛乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)及鑒定28-29
• 3.2 奶牛乳腺上皮干細胞的鑒定29-32
• 3.2.1 FNDC3B和P ROCR的表達定位29-31
• 3.2.2 Brd U標記滯留的疑似奶牛乳腺上皮干/祖細胞31-32
• 3.3 奶牛乳腺上皮細胞的生物學特性32-34
• 3.3.1 奶牛乳腺上皮細胞的染色體檢測32
• 3.3.2 奶牛乳腺上皮細胞的生長曲線32-33
• 3.3.3 奶牛乳腺上皮細胞中泌乳相關基因表達33
• 3.3.4 奶牛乳腺上皮原代及傳代細胞分泌 β-酪蛋白的檢測33-34
• 3.4 黃苷和I GF-Ⅰ對奶牛乳腺上皮細胞及干/ 祖細胞的影響34-37
• 3.4.1 黃苷和IGF-Ⅰ對奶牛乳腺上皮細胞生長曲線的影響34-35
• 3.4.2 黃苷和IGF-Ⅰ對乳腺上皮干細胞標志分子和泌乳相關基因表達的影響35-37
• 4 討論37-41
• 4.1 奶牛乳腺上皮細胞的基本特征37-39
• 4.1.1 奶牛乳腺上皮細胞原代培養(yǎng)及鑒定37-38
• 4.1.2 奶牛乳腺上皮細胞的生物學特性38-39
• 4.2 奶牛乳腺上皮干細胞的鑒定39-40
• 4.2.1 FNDC3B和PROCR是新型乳腺干/祖細胞標志39
• 4.2.2 奶牛乳腺上皮細胞群體中的干細胞39-40
• 4.3 添加黃苷和IGF-Ⅰ對奶牛乳腺上皮細胞群體的影響40-41
• 5 結(jié)論41-42
• 致謝42-43
• 參考文獻43-50
• 附錄50-51
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術(shù)論文51

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王月影;朱河水;王艷玲;;乳腺上皮細胞的鈣轉(zhuǎn)運研究進展[J];江西農(nóng)業(yè)學報;2008年06期

2 楊櫟;李鍵;吳媛媛;田甜;畢琳;梁天宇;;綠色熒光蛋白基因在牦牛乳腺上皮細胞中表達的研究[J];西南民族大學學報(自然科學版);2009年03期

3 吳媛媛;李鍵;楊櫟;畢琳;田甜;;牦牛乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)的研究[J];西南民族大學學報(自然科學版);2009年04期

4 弓超;王凌云;周歡敏;;牛乳腺上皮細胞體外分離和培養(yǎng)[J];動物醫(yī)學進展;2011年07期

5 李吉霞;葛秀國;王文秀;張涌;;牛乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2012年07期

6 符梅;熊顯榮;高川;李宇;王樹茂;李鍵;;麥洼牦牛乳腺上皮細胞系的建立及其生物學特性[J];西北農(nóng)業(yè)學報;2012年11期

7 郝明超;劉r，

本文編號：1095680