本文關(guān)鍵詞：奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)及干細(xì)胞鑒定

  更多相關(guān)文章： 奶牛 乳腺上皮細(xì)胞 干/祖細(xì)胞 標(biāo)記滯留 泌乳

【摘要】：奶牛乳腺上皮細(xì)胞(dairy cow mammary epithelial cells,DCMECs)作為常用的體外實(shí)驗(yàn)工具,為奶牛乳腺發(fā)育、泌乳調(diào)控及乳腺生物反應(yīng)器等方面的研究提供細(xì)胞模型。目前,DCMECs永生化細(xì)胞系的建立尚未成熟,需要在體外誘導(dǎo)并模擬生理?xiàng)l件,通過原代培養(yǎng)來獲得具有泌乳功能的分泌性乳腺上皮細(xì)胞或構(gòu)建三維立體的腺泡模型。乳腺是出生后發(fā)育的器官,青春期首次快速發(fā)育及妊娠期再次發(fā)育都與乳腺干細(xì)胞(mammary stem cells,MaSCs)活躍的自我更新及分化密切相關(guān)。研究表明乳腺中存在一定比例的干細(xì)胞,但區(qū)分鑒定這些多潛能干細(xì)胞的特異性分子標(biāo)志仍不十分明確。一些激素及生長(zhǎng)因子類物質(zhì)在體內(nèi)能夠促進(jìn)乳腺發(fā)育、調(diào)控泌乳,在體外能夠促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖,影響細(xì)胞黏附、遷移、伸展和分化,并且涉及到對(duì)MaSCs的調(diào)控。激素和生長(zhǎng)因子如何影響MaSCs擴(kuò)增、分化并維持其多能性,以及調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)、分化參與體外立體腺泡構(gòu)建的機(jī)制值得深入研究。本研究以原代培養(yǎng)的DCMECs為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?探討短期內(nèi)獲得大量DCMECs的方法,篩選乳腺上皮干細(xì)胞新型分子標(biāo)志,鑒定奶牛乳腺上皮干細(xì)胞,觀察黃苷及IGF-Ⅰ對(duì)乳腺上皮細(xì)胞及乳腺上皮干細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)中采用膠原酶消化法體外培養(yǎng)DCMECs,通過繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、核型分析、Western Blotting檢測(cè)酪蛋白、熒光定量PCR檢測(cè)泌乳相關(guān)基因等實(shí)驗(yàn)技術(shù)與方法評(píng)估原代(或傳代)細(xì)胞的生長(zhǎng)活性與泌乳潛能;利用激光共聚焦顯微技術(shù)進(jìn)行免疫熒光觀察與分析,根據(jù)乳腺上皮干細(xì)胞分子標(biāo)志表達(dá)、Brd U標(biāo)記滯留的特點(diǎn)以及細(xì)胞分裂方式鑒定原代乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)體系中的乳腺上皮干細(xì)胞。結(jié)果表明:(1)主要成分為膠原酶Ⅳ、透明質(zhì)酸酶、DNA酶Ⅰ的消化液混合物在3h內(nèi)高效率消化組織塊,得到的原代及傳代細(xì)胞是具有60條染色體,呈現(xiàn)典型上皮細(xì)胞形態(tài),CK18表達(dá)陽(yáng)性,生長(zhǎng)活力旺盛,能夠合成分泌β-casein的正常DCMECs,可作為后期實(shí)驗(yàn)材料。(2)在體外培養(yǎng)過程中,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)分析P0、P3、P6、P9細(xì)胞中催乳素、生長(zhǎng)激素和胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)及其受體基因的表達(dá)變化,經(jīng)過比較分析發(fā)現(xiàn)原代與傳代后細(xì)胞在激素、生長(zhǎng)因子及其受體mRNA水平上差異極顯著降低(P0.01)。表明在非誘導(dǎo)泌乳分化培養(yǎng)條件下,脫離泌乳生理環(huán)境的DCMECs自身具有的泌乳調(diào)控基因表達(dá)迅速受到抑制。(3)本研究根據(jù)成體干細(xì)胞具有Brd U標(biāo)記滯留的特點(diǎn)檢測(cè)DCMECs中疑似乳腺干/祖細(xì)胞,同時(shí)分析兩種新發(fā)現(xiàn)的MaSCs分子標(biāo)志(FNDC3B和PROCR)的表達(dá)定位,驗(yàn)證應(yīng)用它們指示乳腺上皮干細(xì)胞的可行性。結(jié)果顯示,連續(xù)培養(yǎng)25d后Brd U標(biāo)記滯留上皮細(xì)胞(label-retaining epithelial cells,LRECs)比例接近0.4%,極少數(shù)細(xì)胞呈FNDC3B或PROCR陽(yáng)性,可以觀察到不對(duì)稱分裂細(xì)胞,但在一定培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),DCMECs群體中能夠保留一定比例疑似乳腺干/祖細(xì)胞,提示這些多能奶牛乳腺干/祖細(xì)胞在體外泌乳調(diào)控和乳腺腺泡重塑過程中可能發(fā)揮重要作用。(4)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期添加黃苷及IGF-Ⅰ,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)分析原代及傳代細(xì)胞中催乳素、生長(zhǎng)激素和IGF-Ⅰ及其受體的基因表達(dá),以及干細(xì)胞分子標(biāo)志FNDC3B和PROCR m RNA的表達(dá)變化。添加黃苷及IGF-Ⅰ后,P0-P9細(xì)胞PROCR mRNA的表達(dá)量顯著增高(P0.05),FNDC3B m RNA的表達(dá)量變化不顯著(P0.05),PRL/P RLR、GH/GHR、I GF-I/I GF-IR m RNA的相對(duì)表達(dá)量在P0-P3細(xì)胞中有升高趨勢(shì)而在P6-P9細(xì)胞中有下降趨勢(shì),提示黃苷及IGF-Ⅰ對(duì)上皮細(xì)胞及干細(xì)胞的增殖有一定的促進(jìn)作用,并對(duì)早期乳腺上皮細(xì)胞泌乳基因表達(dá)呈正調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：奶牛 乳腺上皮細(xì)胞 干/祖細(xì)胞 標(biāo)記滯留 泌乳
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S823
【目錄】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 前言12-19
• 1.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞研究進(jìn)展12-14
• 1.1.1 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀12-14
• 1.1.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)14
• 1.2 奶牛乳腺上皮干細(xì)胞研究進(jìn)展14-18
• 1.2.1 干細(xì)胞14-15
• 1.2.2 乳腺上皮干細(xì)胞15-16
• 1.2.3 乳腺上皮干細(xì)胞的調(diào)控16-18
• 1.3 研究的目的與意義18-19
• 2 材料與方法19-28
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器19-20
• 2.3 實(shí)驗(yàn)試劑20-21
• 2.4 實(shí)驗(yàn)方法21-27
• 2.4.1 原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定21-22
• 2.4.2 奶牛乳腺上皮干細(xì)胞的鑒定22-25
• 2.4.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的生物學(xué)特性25-26
• 2.4.4 黃苷和IGF-Ⅰ對(duì)乳腺上皮干細(xì)胞標(biāo)志分子和泌乳相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控26-27
• 2.5 數(shù)據(jù)處理27-28
• 3 結(jié)果與分析28-37
• 3.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定28-29
• 3.2 奶牛乳腺上皮干細(xì)胞的鑒定29-32
• 3.2.1 FNDC3B和P ROCR的表達(dá)定位29-31
• 3.2.2 Brd U標(biāo)記滯留的疑似奶牛乳腺上皮干/祖細(xì)胞31-32
• 3.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的生物學(xué)特性32-34
• 3.3.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的染色體檢測(cè)32
• 3.3.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線32-33
• 3.3.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞中泌乳相關(guān)基因表達(dá)33
• 3.3.4 奶牛乳腺上皮原代及傳代細(xì)胞分泌 β-酪蛋白的檢測(cè)33-34
• 3.4 黃苷和I GF-Ⅰ對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞及干/ 祖細(xì)胞的影響34-37
• 3.4.1 黃苷和IGF-Ⅰ對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響34-35
• 3.4.2 黃苷和IGF-Ⅰ對(duì)乳腺上皮干細(xì)胞標(biāo)志分子和泌乳相關(guān)基因表達(dá)的影響35-37
• 4 討論37-41
• 4.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的基本特征37-39
• 4.1.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定37-38
• 4.1.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的生物學(xué)特性38-39
• 4.2 奶牛乳腺上皮干細(xì)胞的鑒定39-40
• 4.2.1 FNDC3B和PROCR是新型乳腺干/祖細(xì)胞標(biāo)志39
• 4.2.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞群體中的干細(xì)胞39-40
• 4.3 添加黃苷和IGF-Ⅰ對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞群體的影響40-41
• 5 結(jié)論41-42
• 致謝42-43
• 參考文獻(xiàn)43-50
• 附錄50-51
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文51

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6 符梅;熊顯榮;高川;李宇;王樹茂;李鍵;;麥洼牦牛乳腺上皮細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性[J];西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2012年11期

7 郝明超;劉r，

本文編號(hào)：1095680