本文關(guān)鍵詞：miR-29c在鵝肥肝形成中的表達(dá)與功能研究

  更多相關(guān)文章： miR-29c 鵝肥肝 靶基因 脂肪代謝 轉(zhuǎn)錄因子

【摘要】：MicroRNA (miRNA)是一類長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子,主要通過與靶基因的3'UTR區(qū)結(jié)合使靶基因的mRNA翻譯受到抑制或直接降解,從而調(diào)控發(fā)育、代謝和癌癥等生物過程,是基因表達(dá)的重要調(diào)控因子。肝臟是脂肪酸合成的主要場所,在動物的脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)miR-29c可以調(diào)控肝臟的纖維化,并且在抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。然而,在脂肪肝形成過程中miR-29c的表達(dá)與調(diào)控以及其功能尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)對此進(jìn)行較深入的研究,主要結(jié)果如下：1、填肥抑制了miR-29c在肝臟、胸肌和腹脂中的表達(dá)。本研究利用實(shí)時熒光定量技術(shù)測定了填肥朗德鵝與對照朗德鵝(常規(guī)飼養(yǎng))胸肌、腹脂和肝臟中的miR-29c表達(dá)水平。結(jié)果顯示,填肥顯著抑制了這些與脂肪代謝相關(guān)組織中的miR-29c的表達(dá),提示其在鵝肝臟脂肪代謝過程中扮演重要角色。2、miR-29c的靶基因預(yù)測與篩選。依據(jù)雞鵝miR-29c種子序列的保守性,參考雞的基因組序列,利用生物信息學(xué)軟件miRDB、TargetScan、和Microcosm預(yù)測miR-29c的靶基因,兩兩取交集并參考已有文獻(xiàn)篩選得到COL3A1、SGK1、INSIG1、DDX3X、 PPM1D、 TNFAIP3共6個靶基因。然后,通過對預(yù)測靶基因的定量驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)COL3A1、SGK1、INSIG1三個靶基因在填飼后朗德鵝肝臟中的表達(dá)量顯著上調(diào),DDX3X、PPM1D、TNFAIP3的表達(dá)則未出現(xiàn)顯著上調(diào)。依據(jù)miRNA通常與其靶基因表達(dá)量相反,我們推定COL3A1、SGK1和INSIG1最有可能是miR-29c靶基因。3、miR-29c的靶基因驗(yàn)證。首先,設(shè)計候選靶基因3’UTR序列特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)克隆測序獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的序列。再利用pMIR-REPORT分別構(gòu)建靶基因3'UTR靶序列區(qū)的表達(dá)載體,同時依據(jù)獲得的鵝miR-29c成熟序列設(shè)計其模擬物用于靶向關(guān)系的驗(yàn)證。最后,通過在非肝細(xì)胞系CHO中建立的雙熒光素酶系統(tǒng)驗(yàn)證鵝miR-29c的三個靶基因。結(jié)果表明COL3A1、SGK1和INSIG1為鵝miR-29c的靶基因。因此,miR-29c可能通過對這些基因的作用影響鵝肥肝的形成。4、在鵝原代肝細(xì)胞中miR-29c對靶基因表達(dá)的影響。通過設(shè)置miR-29c過表達(dá)組、抑制組以及相應(yīng)的對照組,經(jīng)肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),以及靶基因COL3A1、SGK1、INSIG1的定量檢測,發(fā)現(xiàn)COL3A1和INSIG1的表達(dá)在鵝原代肝細(xì)胞中受到miR-29c的調(diào)控,而SGK1的表達(dá)受miR-29c的調(diào)控可能為肝細(xì)胞中的其他因子所干擾。miR-29c對COL3A1和INSIG1表達(dá)的影響更容易在miR-29c表達(dá)受到抑制時發(fā)生。5、脂肪肝形成相關(guān)因子處理鵝肝細(xì)胞對miR-29c表達(dá)的影響。本研究利用不同濃度的葡萄糖、胰島素、脂肪酸分別處理鵝肝細(xì)胞以檢測對miR-29c表達(dá)的影響,結(jié)果顯示100mmol/L葡萄糖和0.5mmol/L棕櫚酸鉀均可顯著降低miR-29c的表達(dá),但100 nmol/L胰島素和0.5mmol/L油酸鈉對miR-29c表達(dá)的影響甚少。說明高糖、高脂均可以誘導(dǎo)鵝肥肝中miR-29c的表達(dá),進(jìn)一步說明miR-29c的表達(dá)受鵝脂肪肝形成相關(guān)因子的調(diào)控。6、miR-29c介導(dǎo)葡萄糖對鵝肝細(xì)胞中靶基因INSIG1、COL3A1的調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)對鵝原代肝細(xì)胞進(jìn)行miR-29c抑制劑轉(zhuǎn)染和葡萄糖處理,并定量檢測靶基因COL3A1、INSIG1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,100 mmol/L的葡萄糖能使INSIG1的表達(dá)顯著上調(diào),1niR-29c抑制劑能顯著增強(qiáng)這種趨勢,而100 mmol/L的葡萄糖能使C0L3A1的表達(dá)顯著下調(diào),但miR-29c抑制劑能顯著抑制這種下調(diào)。這說明葡萄糖誘導(dǎo)的INSIG1和COL3A1的表達(dá)受到miR-29c的調(diào)控。7、miR-29c的上游轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測及初步驗(yàn)證。首先設(shè)計miR-29c上游序列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)克隆測序獲得上游序列。然后,通過Gene Regulation在線軟件對鵝miR-29c的上游序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測,篩選出轉(zhuǎn)錄因子RFX1。作為轉(zhuǎn)錄因子RFX1活性調(diào)節(jié)劑的維甲酸被用來處理鵝原代肝細(xì)胞。經(jīng)檢測,10μmol/L的維甲酸能使miR-29c的表達(dá)量顯著上調(diào)。這初步說明轉(zhuǎn)錄因子RFX1可能介導(dǎo)了miR-29的表達(dá)調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：miR-29c 鵝肥肝 靶基因 脂肪代謝 轉(zhuǎn)錄因子
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.33
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 縮略詞表10-12
• 1 文獻(xiàn)綜述12-19
• 1.1 鵝肥肝研究進(jìn)展12-13
• 1.2 miRNA概況13-15
• 1.2.1 miRNA的生成13-14
• 1.2.2 miRNA的作用機(jī)制14
• 1.2.3 miRNA與肝臟脂代謝14-15
• 1.3 miR-29c的研究概況15
• 1.4 miRNA的研究技術(shù)15-18
• 1.4.1 miRNA的克隆與高通量測序15-16
• 1.4.2 miRNA的表達(dá)16-17
• 1.4.3 miRNA的靶基因預(yù)測及驗(yàn)證17-18
• 1.5 實(shí)驗(yàn)?zāi)康�、意義及主要研究內(nèi)容18-19
• 2 材料與方法19-40
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料19-25
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及飼養(yǎng)管理19
• 2.1.2 朗德鵝胚胎的孵化19
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備19-20
• 2.1.4 常用實(shí)驗(yàn)試劑及試劑盒20-21
• 2.1.5 主要相關(guān)試劑的配制21-23
• 2.1.6 實(shí)驗(yàn)所需引物設(shè)計23-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟25-40
• 2.2.1 總RNA提取前的準(zhǔn)備25
• 2.2.2 總RNA的提取25-26
• 2.2.3 miRNA反轉(zhuǎn)錄26
• 2.2.4 miRNA的熒光定量PCR26-27
• 2.2.5 靶基因預(yù)測27-28
• 2.2.6 總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA28-29
• 2.2.7 熒光定量PCR(qRT-PCR)29
• 2.2.8 鵝血細(xì)胞基因組DNA提取29-30
• 2.2.9 pMIR-REPORT和PhRL-TK載體質(zhì)粒擴(kuò)繁30
• 2.2.10 載體質(zhì)�；厥�30-31
• 2.2.11 miRNA靶基因的靶位點(diǎn)PCR31-32
• 2.2.12 PCR產(chǎn)物檢測32
• 2.2.13 PCR產(chǎn)物的切膠回收32
• 2.2.14 目的片段和載體雙酶切及回收32-33
• 2.2.15 酶切產(chǎn)物連接33
• 2.2.16 轉(zhuǎn)化及陽性克隆菌鑒定33-34
• 2.2.17 序列分析34
• 2.2.18 轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒的提取34
• 2.2.19 CHO細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)34-35
• 2.2.20 CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染35
• 2.2.21 雙熒光素酶活性檢測35-36
• 2.2.22 鵝原代肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)36-37
• 2.2.23 轉(zhuǎn)染miR-29c mimics或inhibitor37
• 2.2.24 細(xì)胞RNA提取37-38
• 2.2.25 RNA反轉(zhuǎn)錄及熒光定量檢測38
• 2.2.26 葡萄糖、胰島素、脂肪酸、維甲酸分別處理鵝原代肝細(xì)胞38
• 2.2.27 細(xì)胞RNA提取、miRNA反轉(zhuǎn)錄以及miRNA定量檢測38
• 2.2.28 轉(zhuǎn)染miR-29c inhibitor并進(jìn)行葡萄糖處理38-39
• 2.2.29 細(xì)胞RNA提取、反轉(zhuǎn)錄以及定量檢測39
• 2.2.30 鵝miRNA上游序列PCR擴(kuò)增39
• 2.2.31 PCR產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化及陽性克隆菌鑒定39
• 2.2.32 序列比對分析39
• 2.2.33 miR-29c上游轉(zhuǎn)錄因子軟件預(yù)測39
• 2.2.34 數(shù)據(jù)分析39-40
• 3 結(jié)果與分析40-50
• 3.1 填肥對鵝脂肪代謝相關(guān)組織中miR-29c表達(dá)的影響40
• 3.2 miR-29c的靶基因預(yù)測、篩選與驗(yàn)證40-43
• 3.2.1 miR-29c的靶基因預(yù)測40-41
• 3.2.2 miR-29c的候選靶基因在朗德鵝肥肝中的表達(dá)41-42
• 3.2.3 靶序列區(qū)擴(kuò)增以及載體構(gòu)建42-43
• 3.2.4 雙熒光報告系統(tǒng)對miR-29c靶基因的驗(yàn)證43
• 3.3 miR-29c過表達(dá)或抑制后對鵝肝細(xì)胞中靶基因影響43-45
• 3.4 脂肪肝形成相關(guān)因子對鵝原代肝細(xì)胞中miR-29c表達(dá)的影響45-47
• 3.5 miR-29c介導(dǎo)葡萄糖對鵝肝細(xì)胞中靶基因INSIG1、COL3A1的調(diào)控47-48
• 3.6 調(diào)控鵝miR-29c表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測及初步驗(yàn)證48-50
• 4 討論50-54
• 4.1 填肥對鵝脂肪代謝相關(guān)組織中miR-29c表達(dá)的影響50
• 4.2 朗德鵝miR-29c的靶基因預(yù)測與篩選50-51
• 4.3 朗德鵝miR-29c的靶基因驗(yàn)證51
• 4.4 miR-29c過表達(dá)或抑制后對鵝肝細(xì)胞中靶基因影響51-52
• 4.5 脂肪肝形成相關(guān)因子對鵝原代肝細(xì)胞中miR-29c表達(dá)的影響52
• 4.6 miR-29c介導(dǎo)葡萄糖對鵝肝細(xì)胞中靶基因INSIG1、COL3A1的調(diào)控52-53
• 4.7 調(diào)控鵝miR-29c表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測及初步驗(yàn)證53-54
• 5 全文結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-62
• 致謝62-63
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄63-64

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