本文關(guān)鍵詞：鴨補(bǔ)體系統(tǒng)的發(fā)育性變化及RA感染的影響

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【摘要】：鴨疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的鴨病稱為鴨傳染性漿膜炎,該病呈敗血癥形式,以纖維素性心包炎、肝周炎、腦膜炎、氣囊炎和神經(jīng)癥狀以及部分病例出現(xiàn)干酪樣輸卵管炎、結(jié)膜炎、關(guān)節(jié)炎為特征,是養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一,至今幾乎存在于所有養(yǎng)鴨地區(qū)。該細(xì)菌的感染,以發(fā)病率和死亡率高、生長(zhǎng)性能下降、肉品質(zhì)量下降、預(yù)防和治療費(fèi)用增加等造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于RA耐藥性嚴(yán)重,菌株的血清型眾多且缺乏交叉免疫保護(hù),現(xiàn)有免疫接種和抗菌藥物治療措施在生產(chǎn)中的應(yīng)用受到一定的限制。補(bǔ)體(complement,C)系統(tǒng)是人和動(dòng)物固有免疫系統(tǒng)重要的組分之一,不但是機(jī)體防御病原體的第一道防線,參與清除“危險(xiǎn)信號(hào)”,而且在調(diào)控炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的過(guò)程中也發(fā)揮極其重要的作用。補(bǔ)體活性的高低,是動(dòng)物的補(bǔ)體系統(tǒng)抵抗入侵病原微生物能力大小的標(biāo)志。檢測(cè)補(bǔ)體的單個(gè)成分及補(bǔ)體的活性測(cè)定對(duì)于機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能評(píng)價(jià),疾病的診斷與治療,流行病學(xué)調(diào)查等均有重要作用。本試驗(yàn)選取四川麻鴨為研究對(duì)象,通過(guò)建立鴨疫里默氏菌感染模型來(lái)研究RA感染前后鴨補(bǔ)體活性的變化、C3d基因和CR2基因的m RNA表達(dá)變化及C3d和s CR2蛋白含量的變化,旨在揭示鴨疫里默氏桿菌(RA)感染對(duì)鴨補(bǔ)體系統(tǒng)的影響,為進(jìn)一步研究補(bǔ)體在鴨抗RA感染免疫中的作用奠定基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下:1.麻鴨RA感染模型的建立實(shí)驗(yàn)條件下飼喂的10日齡四川麻鴨腿部皮下注射RA菌液0.2m L/只(1×109cfu/m L),接種后168h內(nèi)發(fā)病率80%、死亡率70%,其中接種后24h出現(xiàn)明顯的臨床癥狀、死亡高峰期在36h~60h。病死鴨解剖表現(xiàn)出全身漿膜及各組織器官的被膜纖維素滲出附著,呈現(xiàn)典型的纖維素性心包炎、肝周炎;心臟、肝臟、脾臟充血腫大。2.麻鴨血清補(bǔ)體活性的變化利用溶血素致敏雞紅細(xì)胞及固定血清稀釋度(1:5)測(cè)定麻鴨血清總補(bǔ)體溶血活性。利用1%兔紅細(xì)胞及固定血清稀釋度(1:5)測(cè)定血清補(bǔ)體旁路途徑溶血活性。麻鴨血清總補(bǔ)體溶血活性1~15d逐漸升高,15~21d趨于穩(wěn)定并接近成年麻鴨;旁路途徑溶血活性1~15d逐漸升高,15~21d趨于穩(wěn)定并接近成年麻鴨。10日齡麻鴨人工感染RA,血清總補(bǔ)體溶血活性在感染后12~24h升高,且高于對(duì)照組;36~48h逐漸降低,48~168h逐漸升高,但都低于對(duì)照組。血清旁路途徑溶血活性在感染后12~48h逐漸降低,48~168h逐漸升高,但都低于對(duì)照組。3.麻鴨C3d、CR2 m RNA表達(dá)的變化根據(jù)Genebank上發(fā)表的鴨C3d基因序列(登錄號(hào):EU847624.1)、鴨CR2的EST序列(登錄號(hào):DR765735.1)設(shè)計(jì)引物,分別以肝臟和脾臟提取總RNA為模板建立RT-PCR,克隆測(cè)序得到四川麻鴨C3d和CR2基因片段分別為991bp和347bp。在NCBI上比對(duì)發(fā)現(xiàn)四川麻鴨C3d基因與綠頭鴨C3d基因相似性達(dá)99%,四川麻鴨CR2基因與卷羽鵜鶘CR2基因相似性達(dá)90%。依據(jù)已獲得的C3d、CR2基因序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物,以鴨β-actin基因作內(nèi)參基因,1日齡作對(duì)照,采用2-△△Ct法進(jìn)行C3d、CR2 m RNA的表達(dá)分析。麻鴨C3d m RNA在1~12d表達(dá)升高,12~21d表達(dá)趨于穩(wěn)定;CR2 m RNA的表達(dá)不規(guī)律,在1.00~2.87倍之間,3、6、9、12、15、18和21d的表達(dá)分別是1d的1.73倍、1.45倍、2.55倍、1.68倍、1.39倍、1.82倍和2.87倍。10日齡麻鴨人工感染RA后,C3d m RNA的表達(dá)12~48h逐漸降低,48~168h逐漸升高,且都低于對(duì)照組;CR2 m RNA的表達(dá)在感染后12~48h逐漸降低,48~168h逐漸升高,且都低于對(duì)照組。4.麻鴨C3d、s CR2蛋白含量的變化根據(jù)鴨C3d ELISA試劑盒和鴨可溶性白細(xì)胞分化抗原21(CR2/s CD21)ELISA試劑盒操作說(shuō)明分別測(cè)定麻鴨C3d和s CR2的蛋白含量。麻鴨血清中C3d蛋白含量在1~9d平穩(wěn),9~15d升高,15~21d趨于穩(wěn)定;麻鴨s CR2蛋白含量在1~21d處于一個(gè)較平穩(wěn)的水平。10日齡麻鴨人工感染RA后,血清C3d蛋白含量在感染后12~168h比對(duì)照組高;s CR2蛋白含量在感染后12~72h高于對(duì)照組,而在感染后168h低于對(duì)照組。
【關(guān)鍵詞】：鴨 補(bǔ)體 鴨疫里默氏菌 C3d CR2
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S834
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 第1章 文獻(xiàn)綜述11-25
• 1.1 補(bǔ)體系統(tǒng)概述11-15
• 1.1.1 補(bǔ)體系統(tǒng)成分的分類11-12
• 1.1.2 補(bǔ)體系統(tǒng)的激活12-14
• 1.1.3 補(bǔ)體激活的生物學(xué)效應(yīng)14-15
• 1.2 補(bǔ)體C3d及其受體CR2的分子特征和功能15-18
• 1.2.1 分子特征16-18
• 1.2.2 C3d、CR2結(jié)合的功能18
• 1.3 鴨疫里默氏菌致病機(jī)制18-21
• 1.3.1 侵襲力19-20
• 1.3.2 毒素20-21
• 1.4 病原感染對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的影響21-25
• 第2章 引言25-27
• 第3章 鴨補(bǔ)系統(tǒng)的發(fā)育性變化及RA感染的影響27-59
• 3.1 材料27-28
• 3.1.1 菌種27
• 3.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物27
• 3.1.3 主要試劑及耗材27
• 3.1.4 主要儀器27-28
• 3.2 試驗(yàn)方法28-39
• 3.2.1 雛鴨感染模型的建立28-29
• 3.2.3 血清補(bǔ)體活性的測(cè)定29-31
• 3.2.4 鴨C3d、CR2基因片段的克隆31-36
• 3.2.5 熒光定量PCR36-38
• 3.2.6 C3d和sCR2蛋白含量測(cè)定38-39
• 3.3 結(jié)果39-54
• 3.3.1 鴨疫里默氏菌感染雛鴨39-41
• 3.3.2 麻鴨血清總補(bǔ)體溶血活性41-43
• 3.3.3 麻鴨血清旁路途徑溶血活性43-44
• 3.3.4 麻鴨C3d、CR2基因部分核苷酸序列分析44-45
• 3.3.5 熒光定量PCR引物特異性45-46
• 3.3.6 熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線46-48
• 3.3.7 麻鴨C3d mRNA的表達(dá)48-49
• 3.3.8 麻鴨CR2 mRNA的表達(dá)49-50
• 3.3.9 血清中C3d蛋白含量50-52
• 3.3.10 sCR2的蛋白含量52-54
• 3.4 討論54-59
• 第4章 結(jié)論59-61
• 參考文獻(xiàn)61-67
• 附錄Ⅰ：英文縮略詞表67-69
• 附錄Ⅱ：主要溶液及試劑的配制69-71
• 致謝71-73
• 攻讀碩士期間論文發(fā)表情況73

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本文編號(hào)：1079257