本文關(guān)鍵詞：馬流感病毒反向遺傳系統(tǒng)的建立

  更多相關(guān)文章： 馬流感病毒 JL89 反向遺傳學(xué) 相向轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒 pEZ

【摘要】：馬流感病毒(Equine Influenza Virus,EIV)是感染馬屬動(dòng)物并引發(fā)馬流感的一種重要的傳染病病原。其基因組由8條分節(jié)段的負(fù)鏈RNA構(gòu)成,編碼至少10種蛋白。1989年在中國(guó)黑龍江省和吉林省馬流感疫情中分離到的A/equine/Jilin/1/1989(H3N8)(簡(jiǎn)稱(chēng)JL89)顯示出與其他EIV有顯著的差別。其基因在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上,介于EIV和禽流感病毒之間,且顯示與禽流感病毒有更近的親緣關(guān)系,這提示此病毒可能來(lái)源于禽類(lèi),打破種間屏障傳播給馬。此外,此病毒在馬群中引起較高的發(fā)病率和死亡率。因而研究其分子進(jìn)化與致病機(jī)理對(duì)理解和防控馬流感具有重要意義。反向遺傳學(xué)作為研究病毒的有力工具,在揭示流感病毒的跨種傳播機(jī)制,致病機(jī)理,毒力決定因素等方面發(fā)揮著重要作用。因此,建立針對(duì)JL89的反向遺傳操作系統(tǒng)將為解釋JL89的上述科學(xué)問(wèn)題提供平臺(tái)。首先,本研究構(gòu)建了含有EF1-α和polI啟動(dòng)子的質(zhì)粒pEZ。并利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù),將重組質(zhì)粒pEZ-vEGFP和pEZ分別轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,一方面,pEZ-vEGFP組可以觀察到綠色熒光,而pEZ組觀察不到;另一方面,pEZ-vEGFP組中可以擴(kuò)增出vEGFP編碼區(qū)和其非編碼區(qū),而pEZ組沒(méi)有擴(kuò)增出來(lái);從而在+RNA和-RNA兩個(gè)方面驗(yàn)證pEZ的具有相向轉(zhuǎn)錄的功能。其次,為了獲得JL89基因組全序列,分別對(duì)8個(gè)節(jié)段的編碼區(qū)和非編碼區(qū)克隆并測(cè)序。一方面,利用RT-PCR技術(shù),以提取的病毒RNA為模板,擴(kuò)增8個(gè)節(jié)段,并測(cè)序;另一方面,使用RNA連接和RT-PCR技術(shù),擴(kuò)增8個(gè)非編碼區(qū),并測(cè)序。這樣便獲取了JL89的全基因組序列。然后,利用分子克隆技術(shù)將JL89的8個(gè)全長(zhǎng)的cDNA分別克隆到pEZ中形成重組質(zhì)粒,并通過(guò)western blot分析pEZ-HA轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞中HA蛋白表達(dá)情況,結(jié)果顯示HA表達(dá)良好。進(jìn)一步研究,將8個(gè)重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞拯救病毒。通過(guò)測(cè)定上清中的病毒粒子的TCID50,顯示其滴度達(dá)5.34±0.22個(gè)log10TCID50/mL;經(jīng)雞胚擴(kuò)大培養(yǎng)后測(cè)定其HA效價(jià)達(dá)到8 log2/50μL;在MDCK細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性與親本相似;序列亦與親本100%一致。這些證據(jù)充分顯示已經(jīng)建立起JL89的反向遺傳平臺(tái)。而為了進(jìn)一步提高了本系統(tǒng)的嚴(yán)謹(jǐn)性,通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)在HA節(jié)段上作兩個(gè)點(diǎn)突變使其擁有HindIIII和NdeI酶切位點(diǎn)。經(jīng)RLFP分析顯示拯救出的分子標(biāo)記病毒的HA節(jié)段可以被HindIIII和NdeI分別或同時(shí)切成2或3條帶,而親本的不能。這樣便區(qū)分了拯救的病毒和親本。最后,為了評(píng)價(jià)本系統(tǒng)拯救病毒的能力,以CMV為啟動(dòng)子的pBD系統(tǒng)為參照,通過(guò)TCID50的測(cè)定表明pEZ系統(tǒng)拯救的病毒滴度比PBD系統(tǒng)(3.76±0.69個(gè)log10TCID50/mL)高,且差異顯著。本研究自主構(gòu)建了相向轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pEZ,并用其建立了JL89的反向遺傳操作系統(tǒng),且具有較高的病毒拯救能力。本系統(tǒng)將為進(jìn)一步研究JL89的跨種傳播機(jī)制、致病機(jī)理和毒力決定因素等提供有力的工具。
【關(guān)鍵詞】：馬流感病毒 JL89 反向遺傳學(xué) 相向轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒 pEZ
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 英文縮略表11-12
• 第一章 引言12-22
• 1.1 馬流感病毒的概述12-16
• 1.1.1 馬流感病毒的生物學(xué)12-13
• 1.1.2 馬流感病毒的基因組、蛋白質(zhì)及其功能13-15
• 1.1.3 流感病毒的生命周期15
• 1.1.4 A/equine/Jilin/1/1989(H3N8)15-16
• 1.2 流感病毒的反向遺傳學(xué)的研究現(xiàn)狀16-21
• 1.2.1 依賴(lài)輔助病毒的病毒拯救系統(tǒng)17-18
• 1.2.2 不依賴(lài)輔助病毒的病毒拯救系統(tǒng)18-21
• 1.3 研究的目的與意義21-22
• 第二章 馬流感病毒反向遺傳系統(tǒng)的建立22-38
• 2.1 材料22-23
• 2.1.1 載體、病毒株、菌株、細(xì)胞和雞胚22
• 2.1.2 主要生化試劑22
• 2.1.3 常用緩沖液和培養(yǎng)基22
• 2.1.4 主要儀器22-23
• 2.2 方法23-38
• 2.2.1 細(xì)胞和雞胚的培養(yǎng)23
• 2.2.2 病毒培養(yǎng)23
• 2.2.3 相向轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pEZ的構(gòu)建23-28
• 2.2.4 pEZ的功能驗(yàn)證28-33
• 2.2.5 病毒RNA的提取33
• 2.2.6 JL89基因組全序列的測(cè)定33-34
• 2.2.7 8 個(gè)重組質(zhì)粒的構(gòu)建34
• 2.2.8 HA蛋白的檢測(cè)34-35
• 2.2.9 病毒的拯救35
• 2.2.10 病毒變異體的拯救及鑒定35-36
• 2.2.11 拯救病毒的滴度測(cè)定36
• 2.2.12 拯救病毒的生物學(xué)特性的研究36-37
• 2.2.13 拯救病毒的遺傳學(xué)研究37-38
• 第三章 結(jié)果38-44
• 3.1 成功構(gòu)建載體PEZ且其具有相向轉(zhuǎn)錄的功能38-39
• 3.2 獲得JL89基因組全序列及序列分析39-40
• 3.3 成功構(gòu)建8個(gè)重組質(zhì)粒且PEZ-HA的蛋白表達(dá)良好40-41
• 3.4 成功拯救出EIV病毒41-42
• 3.5 PEZ系統(tǒng)拯救病毒的滴度較PBD系統(tǒng)高42-43
• 3.6 救獲病毒和親本毒生物學(xué)特性相似43
• 3.7 救獲病毒和親本毒遺傳學(xué)特性一致43-44
• 第四章 討論44-46
• 第五章 全文結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-55
• 附錄55-62
• 致謝62-63
• 作者簡(jiǎn)歷63

【相似文獻(xiàn)】

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