本文關鍵詞：脊髓灰質炎病毒株假病毒顆粒的研究和適用

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【摘要】：脊髓灰質炎病毒(簡稱脊灰病毒)感染可引起急性腸道傳染病脊髓灰質炎(簡稱脊灰),其主要病狀為肢體麻痹、下肢發(fā)育不全和功能障礙,并造成終身殘疾。脊髓灰質炎減毒活疫苗(Oral Polio Vaccine,OPV)和脊髓灰質炎滅活苗(Inactive Polio Vaccine,IPV)是主要的流行病學預防手段。但是,在使用OPV的國家發(fā)現(xiàn)了罕見的疫苗相關麻痹型脊灰和疫苗衍生脊灰病毒病例,這提示我們進一步加強對疫苗生產(chǎn)的質量控制力度十分必要,準確排查疑似脊灰患者的手段仍需加強。本研究旨在構建三型脊髓灰質炎病毒株(sabin I型、sabin II型和sabin III型)的假病毒顆粒Armored RNA-sab I、Armored RNA-sab II和Armored RNA-sab III,并以構建得到的假病毒顆粒作為實時熒光定量聚合酶鏈式反應(q RT-PCR)的陽性標準品,實現(xiàn)對待測樣本中脊髓灰質炎病毒拷貝數(shù)的測定。本研究中使用PAR工程質粒作為載體,分別連接脊髓灰質炎病毒株sabin I型、sabin II型和sabin III型的特異基因片段sab I、sab II、sab III,得到的重組質粒轉化后篩選陽性克隆。經(jīng)鑒定的重組菌株在LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)、誘導后富集菌體,然后進行裂解和核酸酶處理,制備假病毒顆粒Armored RNA-sab I、Armored RNA-sab II和Armored RNA-sab III的粗提液。假病毒顆粒粗提液經(jīng)核酸水平和蛋白質水平檢測后,用來制作q RT-PCR標準曲線的標準品發(fā)揮其適用功能。
【關鍵詞】：假病毒顆粒 脊髓灰質炎病毒 實時熒光定量聚合酶鏈式反應 標準品
【學位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R512.4
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-8
• 第1章 緒論8-14
• 1.1 課題背景及研究的目的和意義8-10
• 1.1.1 脊髓灰質炎和脊髓灰質炎病毒8-9
• 1.1.2 脊髓灰質炎疫苗和減毒活疫苗質控9-10
• 1.2 假病毒顆粒及其相關理論的發(fā)展概況10-11
• 1.3 TA克隆11
• 1.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應11-12
• 1.5 本文的主要研究內(nèi)容12
• 1.6 本文的技術路線12-14
• 第2章 實驗材料與方法14-38
• 2.1 實驗材料14-22
• 2.1.1 病毒株、菌種、細胞、國家標準品14
• 2.1.2 載體14-15
• 2.1.3 主要儀器與耗材15-16
• 2.1.4 主要試劑及其配制16-22
• 2.1.5 設計軟件和分析軟件22
• 2.2 實驗方法22-38
• 2.2.1 構建重組質粒22-30
• 2.2.2 制備假病毒顆粒30-31
• 2.2.3 western blotting和蛋白質顯色31-34
• 2.2.4 病毒滴度測定34
• 2.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應34-37
• 2.2.6 假病毒顆粒對RNase耐受的檢驗37-38
• 第3章 構建重組質粒和誘導假病毒顆粒的表達38-48
• 3.1 引言38
• 3.2 特異性擴增脊髓灰質炎病毒目的片段38-39
• 3.3 構建重組質粒39-44
• 3.3.1 中間重組質粒的鑒定39-40
• 3.3.2 重組質粒的鑒定與全長測序40-44
• 3.3.3 重組菌株保種44
• 3.4 誘導條件44-46
• 3.4.1 誘導劑終濃度與誘導表達豐度的關系44-45
• 3.4.2 誘導時間與誘導表達豐度的關系45-46
• 3.5 假病毒顆粒粗提液的制備46
• 3.6 本章小結與討論46-48
• 第4章 假病毒顆粒的定性檢測48-54
• 4.1 引言48
• 4.2 假病毒顆粒的蛋白質水平定性檢測48-52
• 4.2.1 蛋白質免疫印跡實驗及其它染色實驗48-49
• 4.2.2 假病毒顆粒的形態(tài)學觀察49-52
• 4.3 假病毒顆粒的核酸水平定性檢測52-53
• 4.3.1 假病毒顆粒的核糖核酸酶耐受52
• 4.3.2 假病毒顆粒純化后的溴化乙錠染色52-53
• 4.4 本章小結與討論53-54
• 第5章 假病毒顆粒的定量檢測與適用54-62
• 5.1 引言54
• 5.2 實時熒光定量PCR測定假病毒顆�？截悢�(shù)54-58
• 5.3 脊髓灰質炎病毒株國家標準品的拷貝數(shù)測定58-59
• 5.4 脊髓灰質炎病毒株國家標準品的滴度測定59
• 5.5 溫度敏感性試驗59-60
• 5.6 假病毒顆粒的型特異性分析60-61
• 5.7 本章小結與討論61-62
• 結論62-63
• 參考文獻63-67
• 致謝67-68
• 附錄68-76

【引證文獻】

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 范行良;劉悅越;國泰;;脊髓灰質炎疫苗現(xiàn)狀概述[A];2013年中國藥學大會暨第十三屆中國藥師周論文集[C];2013年

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本文編號：593263