目的:Caveolin-1 shRNA(Cav-1 shRNA)慢病毒載體構(gòu)建,進(jìn)一步構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)Cav-1的單克隆人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株,實(shí)時(shí)熒光定量PCR篩選抑制率最好的單克隆人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株。方法:(1)篩選出人Cav-1基因干擾序列。制備雙鏈DNA oligo,利用基因重組技術(shù)克隆慢病毒表達(dá)載體pHBLV-U6-Scramble-ZsGreen-Puro,提取質(zhì)粒并雙酶切后行DNA測(cè)序鑒定慢病毒載體。將慢病毒包裝輔助質(zhì)粒和制作的含Cav-1-shRNA的慢病毒載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收集病毒顆粒并用孔稀釋法測(cè)定病毒滴度。另外,利用上海漢恒生物科技有限公司的陰性序列病毒作為陰性對(duì)照。(2)將病毒感染人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株,挑取2組GFP強(qiáng)表達(dá)的細(xì)胞克隆團(tuán)轉(zhuǎn)移種植,建立穩(wěn)定單克隆細(xì)胞株,熒光定量PCR檢測(cè)Cav-1抑制率,選取抑制率最好的克隆組。結(jié)果:經(jīng)測(cè)序鑒定成功構(gòu)建了慢病毒載體Cav-1 shRNA;利用293T細(xì)胞包裝重組慢病毒載體后,收集到重組慢病毒顆粒,病毒滴度為:2×10⁸TU/mL;成功擴(kuò)增獲得2株穩(wěn)定低表達(dá)Cav-1的單克隆人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖1-2重組慢病毒載體測(cè)序峰圖(部分)

RNA沉默Caveolin-1基因?qū)IV-1TAT誘導(dǎo)的血腦屏障破壞和Aβ的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用機(jī)制碩士學(xué)位論文GGACATC1-1重組慢病毒載體測(cè)序結(jié)果(黃色部分為插入的shRNA序列)ig.1-1Sequenceresultsoflentivect....

圖2重組慢病毒滴度測(cè)定結(jié)果

8TU/mL。圖2重組慢病毒滴度測(cè)定結(jié)果Fig.2Thevirustiteroflentivetor明視野100X熒光視野100XCtrshRNA-0.1ulCtrshRNA-0.033uLCav-1shRNA-0.1ulCav-1shRNA-0.033ul

圖3CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活性不同濃度梯度（0,0.5,1,1.5,2,2.5,3μg/mL）Puromycin處理24h對(duì)HBEC-5i細(xì)胞活性的影響

shRNA沉默Caveolin-1基因?qū)IV-1TAT誘導(dǎo)的血腦屏障破壞和Aβ的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用機(jī)制碩士學(xué)位3.細(xì)胞嘌呤霉素（Puromycin）活性篩選實(shí)驗(yàn)中的Cav-1shRNA載體含有puro抗性基因，使用Puromycin可以殺死轉(zhuǎn)染的細(xì)胞從而篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染....

圖4-1慢病毒感染人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率評(píng)價(jià)(72h)

按照人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的MOI值為60，分別在人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中加入CtrshRNA重組慢病毒和Cav-1shRNA重組慢病毒90μL。轉(zhuǎn)染72h后熒光顯微鏡下觀察感染效率>80%(圖4-1);然后制作單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，從96孔板傳代轉(zhuǎn)移到6孔板中的時(shí)間周期，人腦血管....

本文編號(hào)：3987506