我們前期研究中,從具有廣譜中和活性的HIV-1感染者(DRVI01)分離獲得了一株針對(duì)CD4結(jié)合位點(diǎn)的VRC01樣廣譜單克隆中和抗體DRVIA7(A7)。系統(tǒng)分析A7連續(xù)5年間的發(fā)展表明,抗體重鏈在兩年內(nèi)快速成熟,但抗體輕鏈發(fā)展受阻于gp120蛋白LoopD區(qū)及V5區(qū)的糖鏈,導(dǎo)致該譜系抗體有限的中和寬度。如果能找到與A7譜系早期抗體結(jié)合的膜蛋白(Env),或通過(guò)Env改造設(shè)計(jì)中和難度逐漸加大的免疫原,或許能誘導(dǎo)出A7樣抗體甚至幫助抗體越過(guò)糖分子障礙。本課題將在前期對(duì)A7抗體研究的基礎(chǔ)上,系統(tǒng)分析感染者五年間6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的病毒膜蛋白及其中和表型特征。第一部分對(duì)DRVI01感染者的膜蛋白基因及其中和特征研究中,我們通過(guò)單拷貝基因組擴(kuò)增(SGA)技術(shù)獲得156條全長(zhǎng)膜蛋白基因,篩選鑒定出68個(gè)功能性膜蛋白并制備了假病毒。序列分析和假病毒中和實(shí)驗(yàn)顯示,DRVI0]體內(nèi)膜蛋白序列多樣性的逐漸增加與A7譜系抗體的出現(xiàn)和成熟一致;廣譜高效中和活性及自體病毒逃避同期血漿中和的能力,與膜蛋白上抗體識(shí)別位點(diǎn)較多的氨基酸變異一致,提示病毒和抗體間連續(xù)的共進(jìn)化現(xiàn)象。序列分析還發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)可能有利于CD4bs抗體識(shí)...

【文章頁(yè)數(shù)】：145 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖１．?ＤＲＶＩ０１的膜蛋白Ｎ－Ｊ進(jìn)化樹(shù)圖，包括六個(gè)時(shí)間點(diǎn)的１５６條膜蛋白序列和ＨＸＢ２

２．１膜蛋白基因系統(tǒng)進(jìn)化分析??將六個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲得的膜蛋白基因序列和Ｂ亞型參考序列ＨＸＢ２通過(guò)ＭＥＧＡ５．０５構(gòu)建??Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ進(jìn)化樹(shù)（圖１），相同時(shí)間點(diǎn)的序列標(biāo)記為同一種顏色。結(jié)果顯示不同??時(shí)間點(diǎn)的序列相互交叉分布，提示ＨＩＶ－１在機(jī)體免疫壓力下的連續(xù)進(jìn)....

圖２．Ｇｐｌ６０氨基酸長(zhǎng)度、糖基化數(shù)目及ＮＸＴ：ＮＸＳ比值的比較

２．３膜蛋白序列長(zhǎng)度及糖基化位點(diǎn)分析??為了分析膜蛋白的變化特征，我們比較了六個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的膜蛋白序列氨基酸長(zhǎng)度??及糖基化數(shù)目，以及ＮＸＳ與ＮＸＴ的比值。如圖２所示，六個(gè)時(shí)間點(diǎn)的膜蛋白氨基酸長(zhǎng)??度比較恒定，相互間無(wú)顯著差異。但六個(gè)時(shí)間點(diǎn)的糖基化數(shù)目變異較大，最后一個(gè)時(shí)間??點(diǎn)....

圖３．ＤＲＶＩ０１膜蛋白ＶＲＣ０１抗體主要表位在六個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)化模式分析??３假病毒中和敏感性分析??

圖３．ＤＲＶＩ０１膜蛋白ＶＲＣ０１抗體主要表位在六個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)化模式分析??３假病毒中和敏感性分析??使用五個(gè)時(shí)間點(diǎn)的功能性克隆構(gòu)建的假病毒，分別和各時(shí)間點(diǎn)的自體血漿、六種代??表性單克隆ｂＮＡｂｓ及重構(gòu)的Ａ７譜系抗體進(jìn)行中和試驗(yàn)，以分析該病人膜蛋白的中和特??征。??３．１假病毒....

圖１．?ｇｐｌ２０與ＶＲＣＯ丨復(fù)合物表面結(jié)構(gòu)圖，綠色部分為ｇｐｌ２０部分，棕色部分為ＶＲＣ０１輕鏈，??紫色為ＶＲＣ０１重鏈，方框部分為ｇｐｌ２０的ＬｏｏｐＤ區(qū)

?第：：部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果??變引起的結(jié)構(gòu)變化（圖１、圖２）。??１．５．１?ＬｏｏｐＤ區(qū)Ｄ２７９Ｅ、Ｋ２８１Ｒ突變株結(jié)構(gòu)模擬分析??根據(jù)上述點(diǎn)突變和區(qū)域置換的結(jié)果，ＬｏｏｐＤ區(qū)的Ｄ２７９Ｅ、Ｋ２８１Ｒ突變以及Ｖ５區(qū)的??Ｅ４６４Ｔ突變是造成ＤＲＶＩ０１患者ＨＩＶ－１毒株對(duì)ＶＲＣ０１抵....

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