本文關(guān)鍵詞：梅毒螺旋體膜蛋白Tp92致炎作用機制的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本文選擇在機體非特異性免疫中發(fā)揮重要抗感染作用的巨噬細胞和梅毒螺旋體早期感染中主要接觸的微血管內(nèi)皮細胞(HMEC-1)為靶細胞,來探討Tp92是否可作為一個觸發(fā)器啟動宿主細胞主要炎癥信號轉(zhuǎn)導通路,并篩選出Tp92可能的靶細胞炎癥信號轉(zhuǎn)導通路,為進一步揭示Tp致病的分子機制打下基礎(chǔ)。本實驗用Tp92蛋白分別刺激巨噬細胞和HMEC-1細胞,ELISA檢測其促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平。并根據(jù)預測的My D88/NF-κB、MAPKs/p38和NLRP3/Caspase-1三條信號轉(zhuǎn)導通路,分別用其特異性抑制劑PDTC(Pyrrolidinedithiocarbamic acid)、SB202190和Z-YVAD-FMK阻斷,ELISA檢測Tp92作用靶細胞前后促炎細胞因子的分泌水平差異。若促炎細胞因子分泌水平有顯著下降,既用Western blot檢測Tp92作用靶細胞前后My D88、NF-κB、MAPK1/2、p38 MAPK、Caspase-1和NLRP3分子的表達水平差異;最后通過總活性比色法定量檢測Tp92作用靶細胞前后乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)的活性變化。研究結(jié)果如下:有效表達一個約92k Da大小的分泌性蛋白,經(jīng)純化后純度達85%以上;一定濃度的Tp92蛋白可顯著誘導巨噬細胞和HMEC-1細胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β和IL-6;特異性阻斷My D88/NF-κB和MAPKs/p38信號通路后,ELISA結(jié)果顯示巨噬細胞和HMEC-1細胞分泌的促炎細胞因子較阻斷前均無明顯降低,LDH活性檢測結(jié)果顯示LDH的活性也無明顯差異,而特異性阻斷NLRP3/Caspase-1信號通路后,ELISA結(jié)果顯示巨噬細胞和HMEC-1細胞分泌的TNF-α、IL-6和IL-1β較阻斷前有明顯降低(P0.05);Western blot結(jié)果顯示Caspase-1和NLRP3分子的表達水平較阻斷前均有明顯降低;LDH活性檢測結(jié)果顯示LDH的活性較阻斷前也有明顯降低(P0.01)。本實驗得出結(jié)論,Tp92能促進巨噬細胞和HMEC-1細胞產(chǎn)生促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6,并且Tp92致使巨噬細胞和HMEC-1細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)可能是通過NLRP3/Caspase-1途徑。
【關(guān)鍵詞】：梅毒螺旋體 Tp92 炎癥 信號通路
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R759.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 緒論12-16
• 第2章 實驗材料16-20
• 2.1 主要實驗儀器16-17
• 2.2 載體、菌株及細胞株17
• 2.3 主要實驗試劑17-20
• 2.3.1 主要試劑盒17
• 2.3.2 主要實驗試劑17-18
• 2.3.3 培養(yǎng)基及溶液18-19
• 2.3.4 其他19-20
• 第3章 實驗方法20-40
• 3.1 Tp92目的基因的擴增20-23
• 3.1.1 Tp Nichols標準株全基因組DNA模板的提取20-21
• 3.1.2 Tp92的引物設(shè)計21
• 3.1.3 PCR擴增21-22
• 3.1.4 PCR產(chǎn)物的純化22-23
• 3.2 構(gòu)建Tp92原核表達載體23-28
• 3.2.1 pET-43.1a(+)質(zhì)粒的擴增與純化23-25
• 3.2.2 制備感受態(tài)細菌25-26
• 3.2.3 Tp92和pET-43.1a(+)質(zhì)粒的雙酶切26
• 3.2.4 純化雙酶切后的Tp92和pET-43.1a(+)質(zhì)粒26
• 3.2.5 Tp92和pET-43.1a(+)質(zhì)粒的連接26-27
• 3.2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化27
• 3.2.7 重組質(zhì)粒的篩選與鑒定27-28
• 3.3 Tp92重組蛋白的表達、純化與鑒定28-33
• 3.3.1 摸索Tp92重組蛋白的最佳表達條件28
• 3.3.2 Tp92重組蛋白的純化28-30
• 3.3.3 Tp92重組蛋白的濃縮30-31
• 3.3.4 Tp92重組蛋白去內(nèi)毒素31
• 3.3.5 Western Blot鑒定31-32
• 3.3.6 蛋白濃度的測定32-33
• 3.4 細胞培養(yǎng)和傳代33
• 3.4.1 THP-1 細胞33
• 3.4.2 HMEC-1 細胞33
• 3.5 初步探索Tp92的致炎作用33-36
• 3.5.1 Tp92刺激靶細胞33-35
• 3.5.2 ELISA檢測促炎細胞因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平35-36
• 3.6 ELISA檢測阻斷各信號通路前后各促炎細胞因子的水平變化36-37
• 3.6.1 巨噬細胞36
• 3.6.2 HMEC-1 細胞36-37
• 3.7 Western Blot檢測阻斷各信號通路前后關(guān)鍵分子的水平變化37-38
• 3.7.1 巨噬細胞37
• 3.7.2 HMEC-1 細胞37-38
• 3.7.3 Western Blot檢測38
• 3.8 LDH法檢測阻斷各信號通路前后靶細胞內(nèi)LDH的水平變化38-40
• 3.8.1 巨噬細胞38-39
• 3.8.2 HMEC-1 細胞39
• 3.8.3 乳酸脫氫酶檢測39-40
• 第4章 實驗結(jié)果40-56
• 4.1 Tp92目的蛋白的誘導表達與鑒定40-44
• 4.1.1 Tp92基因的PCR擴增結(jié)果40
• 4.1.2 Tp92/pET-43.1a(+)重組質(zhì)粒的菌液PCR鑒定40-41
• 4.1.3 Tp92/pET-43.1a(+)重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定41-42
• 4.1.4 Blast比對42
• 4.1.5 Tp92重組蛋白的表達42-43
• 4.1.6 Tp92重組蛋白純化、去內(nèi)毒素之后的Western Blot分析43-44
• 4.1.7 測定Tp92重組蛋白最終濃度44
• 4.2 Tp92刺激不同時間對細胞因子分泌的影響44-47
• 4.3 PDTC對Tp92誘導靶細胞分泌促炎細胞因子的影響47-48
• 4.4 SB202190對Tp92誘導靶細胞分泌促炎細胞因子的影響48-50
• 4.5 Z-YVAD-FMK對Csapase-1 和NLRP3的表達及促炎細胞因子的分泌的影響50-53
• 4.6 LDH法檢測阻斷各信號通路前后靶細胞內(nèi)LDH的水平變化53-56
• 第5章 討論56-62
• 第6章 結(jié)論62-64
• 參考文獻64-70
• 文獻綜述70-100
• 梅毒螺旋體外膜蛋白 Tp92 及其同源蛋白的研究進展70-81
• 參考文獻77-81
• Autophagy, an inhibitor of NLRP3 inflammasome activation81-100
• References92-100
• 作者攻讀學位期間的科研成果100-102
• 致謝102

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 吳冷;王駿;趙蕾;吳亞菲;;核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域亞家族成員3炎癥小體的活化調(diào)節(jié)與牙周疾病的關(guān)系[J];國際口腔醫(yī)學雜志;2015年06期

2 甘霖;趙飛駿;;梅毒螺旋體外膜蛋白Tp92及其同源蛋白的研究進展[J];微生物學免疫學進展;2014年01期

  本文關(guān)鍵詞：梅毒螺旋體膜蛋白Tp92致炎作用機制的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：313279