本文關(guān)鍵詞：維生素D誘導(dǎo)自噬對(duì)巨噬細(xì)胞清除結(jié)核分枝桿菌的作用的實(shí)驗(yàn)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：機(jī)體內(nèi)巨噬細(xì)胞(macrophage, MΦ)與結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)的相互作用影響著結(jié)核病(tuberculosis,TB)的發(fā)展方向,增強(qiáng)Mφ對(duì)胞內(nèi)Mtb的殺滅能力成為治療TB和減少發(fā)病的重要策略。維生素D通過(guò)與維生素D受體(Vitamin D receptor,VDR)的結(jié)合,對(duì)誘導(dǎo)Mφ自噬以及自噬溶酶體的成熟發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。本課題旨在研究維生素D誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生自噬并清除巨噬細(xì)胞內(nèi)Mtb的作用。方法：(1)建立Mφ感染Mtb的體外模型：使用豆蔻酰佛波醇乙酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)誘導(dǎo)人單核巨噬細(xì)胞系U937分化,使之具有吞噬能力,分化后的U937細(xì)胞經(jīng)Mtb標(biāo)準(zhǔn)人型毒力株H37Rv處理,建立Mφ感染Mtb的體外模型。(2)實(shí)驗(yàn)分組：分化的U937細(xì)胞隨機(jī)分為：陰性對(duì)照組(RPMI1640培養(yǎng)基,24小時(shí))、維生素D組[100pM 1,25 (OH) 2D3,24小時(shí)]、自噬抑制劑+維生素D組[10μM 3-甲基腺嘌呤(3-methyl adenine,3-MA)+100pM 1,25(OH) 24小時(shí)]、陽(yáng)性對(duì)照組(10nM雷帕霉素,18小時(shí)),各組細(xì)胞以H37Rv感染(細(xì)菌：細(xì)胞=10：1)4小時(shí)。(3)檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)：感染后第4天,利用臺(tái)盼藍(lán)染料排斥試驗(yàn)評(píng)價(jià)藥物的細(xì)胞毒性。半定量RT-PCR檢測(cè)自噬相關(guān)基因(autophagy-related genes,Atg)Atg5、Beclin-1及人抗菌肽LL-37、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain3,LC3) B mRNA的表達(dá)。Western Blotting檢測(cè)LL-37、 LC3B-Ⅱ蛋白的表達(dá)。分別計(jì)數(shù)感染后第1、4天細(xì)胞內(nèi)Mtb的菌落形成單位(colony forming units,cfu)。流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)感染后第4天LC3B-Ⅱ+和／或結(jié)核分枝桿菌抗原85 A+(Ag85A+)的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果：(1)實(shí)驗(yàn)中臺(tái)盼藍(lán)染料排斥試驗(yàn)顯示細(xì)胞存活率均達(dá)96%以上；(2)與對(duì)照組相比,半定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)維生素D組Atg5, Beclin-1、LL-37、LC3B mRNA的表達(dá)增強(qiáng)(P0.01);(3)Western Blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)維生素D組LL-37蛋白的表達(dá)增加(P0.01)及LC3B-Ⅱ蛋白的表達(dá)增加(P0.05)；(4)感染后第1天維生素D組細(xì)胞內(nèi)Mtb的菌落數(shù)無(wú)明顯改變(P0.05),而感染后第4天維生素D組細(xì)胞內(nèi)Mtb的菌落數(shù)顯著減少(P0.01)；(5)與陰性對(duì)照組比較,流式細(xì)胞術(shù)顯示維生素D組LC3B-Ⅱ+-細(xì)胞增多,Ag85A+-細(xì)胞減少,且LC3B-Ⅱ+-Ag85A--細(xì)胞增加(維生素D組65.1%比陰性對(duì)照組2.22%)；(6)與維生素D組相比,在白噬抑制劑3-MA+維生素D組中,不但Atg5. Beclin-1、LC3B的mRNA表達(dá)受到抑制,LL-37的mRNA表達(dá)減少,LL-37、LC3B-Ⅱ蛋白的表達(dá)較維生素D組減少；而且3-MA抑制了1,25(OH)2D3對(duì)感染后第4天細(xì)胞內(nèi)Mtb的菌落數(shù)的減少,同時(shí)抑制了1,25(OH)2D3對(duì)LC3B-Ⅱ+-Ag85A--細(xì)胞的增加。結(jié)論：維生素D能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生自噬作用,并進(jìn)一步有助于巨噬細(xì)胞清除結(jié)核分枝桿菌。
【關(guān)鍵詞】：維生素D 自噬 結(jié)核分枝桿菌 巨噬細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R52
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照5-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 前言14-16
• 第一部分 維生素D對(duì)感染結(jié)核分枝桿菌的巨噬細(xì)胞的自噬作用的影響16-33
• 1 材料和方法16-27
• 2 結(jié)果27-30
• 3 討論30-33
• 第二部分 維生素D誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的自噬作用與巨噬細(xì)胞清除胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的關(guān)系33-42
• 1 材料和方法33-36
• 2 結(jié)果36-38
• 3 討論38-42
• 全文總結(jié)42-43
• 參考文獻(xiàn)43-46
• 文獻(xiàn)綜述46-54
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 致謝54-55
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文55

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本文編號(hào)：296582