本文關(guān)鍵詞：RHCE基因編碼區(qū)測序技術(shù)及血源性瘧疾檢測的新方法

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【摘要】：PART IRHCE基因編碼區(qū)測序技術(shù)背景：Rh血型系統(tǒng)包括50多個抗原,與臨床密切相關(guān)的抗原主要有D、C、c、E和e等抗原。Rh血型系統(tǒng)中除D抗原具有很強的免疫原性外,RhC,c,E和e抗原可導(dǎo)致新生兒溶血病(hemolytic disease of fetal and newborn,HDFN)和遲發(fā)性溶血性輸血反應(yīng)(delayed hemolytic transfusion reaction,DHTR).長期異體輸血產(chǎn)生的不規(guī)則抗體所引起的輸血反應(yīng)日趨受到關(guān)注,其中又以Rh血型系統(tǒng)的相關(guān)抗體(抗-E抗-C抗-e抗-c)所引起的輸血反應(yīng)最為常見和具有臨床意義,Rh血型不相合的血液的長期輸注將嚴重影響臨床輸血的安全性與有效性。正確的定型是配型輸血的前提。目前臨床血型定型的主要方法仍然是血清學(xué)方法,而血清學(xué)方法在實際應(yīng)用過程中由于存在多種細胞群或嵌合現(xiàn)象,如長期定期輸血后、造血干細胞移植后、輸注ABO血型不符血液后等引起的混合凝集；直抗陽性個體,由于高效價自身抗體的存在,使自身抗體可以在體外與所有紅細胞發(fā)生強烈的抗原抗體反應(yīng)；弱表達抗原,由于膜抗原分子數(shù)或抗原位點數(shù)減少,使得抗原抗體反應(yīng)或血清學(xué)檢測結(jié)果減弱,常常被鑒定為陰性；以及其他一些臨床面臨的困難如紅細胞標本量不足或缺少等。PCR技術(shù)的發(fā)展對血型分子水平的研究具有劃時代的意義。目前國內(nèi)外最常用的PCR基因定型技術(shù)是序列特異性引物PCR技術(shù)(sequence specificprimer-Polymerase Chain Reaction,PCR-SSP), PCR-SSP作為一種特異性的基因序列多態(tài)性分析技術(shù),其基本原理是根據(jù)堿基序列的差異設(shè)計序列特異性引物,這對引物僅能與目的序列的完全互補配對,擴增出目的序列,再根據(jù)擴增產(chǎn)物的有無進行定型。價格低廉、應(yīng)用簡便和特異性強使得PCR-SSP技術(shù)在血型鑒定領(lǐng)域得到快速發(fā)展,目前市場上已有許多成熟的血型基因定型試劑盒。RHCE基因定型的依據(jù)是RhC/c及RhE/e抗原多態(tài)性的分子機制,即RhC/c是由于RHCE基因第1、2外顯子發(fā)生了6個堿基置換(分別是48GC、150C、178C A、201AG、203AG和307CT)并導(dǎo)致4個氨基酸的替換(分別是第16位Cys→Trp、60位ILe→Leu、68位Ser→Asn和103位Ser→Pro),涉及第2個胞外環(huán)；RhE/e抗原是由于第5外顯子1個堿基置換(C→G)導(dǎo)致了1個氨基酸的替換(第226位Pro→la),涉及第4個胞外環(huán)。PCR-SSP技術(shù)應(yīng)用于RHCE基因分型的缺點也很明顯,1)PCR-SSP方法存在一定比例的假陽性或假陰性結(jié)果,RHC等位基因的檢測會因RHc在第1外顯子第48位點的突變干擾而導(dǎo)致假陽性結(jié)果,且會因109 bp插入序列的缺失而導(dǎo)致假陰性結(jié)果,RHc等位基因的檢測會因RHCE基因第2外顯子的第178、201、203和(或)307位點堿基突變的而影響定型結(jié)果。2)RHCE等位基因的多態(tài)性對PCR-SSP的影響,研究表明目前觀察到的RHCE等位基因已超過70個,但PCR-SSP技術(shù)很難同時用于檢測所有的RHCE等位基因,尤其是低頻抗原的基因型。3)復(fù)雜遺傳因素對PCR-SSP的影響,不同民族和不同人群的RH基因有著不同的遺傳背景。同時,高加索人存在更多的RHD和RHCE基因稀有變異型,這其中不僅包括各種堿基替代、插入和缺失,還包括更為復(fù)雜的RHCE/RHD基因交換。這些復(fù)雜的變異導(dǎo)致PCR-SSP常常在基因定型中出現(xiàn)假陰性和(或)假陽性,甚至無法定型。隨著測序方法尤其是二代測序的發(fā)展,測序越來越來簡便快速且越來越廉價,測序逐漸成為繼PCR-SSP技術(shù)后又一大新的基因定型和序列分析技術(shù),以往文獻報道多是針對RHCE基因的某個或某幾個外顯子進行序列分析,不利于觀察整個RHCE基因編碼區(qū),為此本文設(shè)計一種簡易的RHCE基因編碼區(qū)全長測序方法,并用于長期輸血患者、疑難血型樣本、RHCE基因變異個體及家系的研究,以及RhCcEe血型配型輸血。目的：本研究旨在一種簡易的RHCE基因編碼區(qū)全長測序方法,方便臨床實驗室使用的RHCE基因定型方法。方法：1.研究對象和材料實驗樣本來源于深圳市血液中心采集的400份隨機的無償獻血者樣本,來源于陜西省血液中心的1個D--個體樣本,1例來源于深圳市血液中心Rh陰性樣本,以及1例弱E樣本來自遼寧省血液中心(以下簡稱為弱E樣本)。上述所有實驗樣本均經(jīng)過血液中心法定檢測項目的合格血液。2.實驗方法(1)血清學(xué)檢測：采用抗-RhC、抗-Rhc、抗-RhE和抗-Rhe血清檢測樣本紅細胞表面RhCcEe抗原表型。(2)PCR-SSP基因定型：利用RHCE基因與RHD基因的序列的差異以及RHCE等位基因多態(tài)性特點,設(shè)計RHC、RHc、RHE和RHe四個擴增體系,根據(jù)相應(yīng)體系內(nèi)擴增產(chǎn)物的有無來定型。(3)測序：依據(jù)RHCE基因序列的特異性,設(shè)計10對特異性引物分別擴增RHCE基因的10個外顯了,擴增產(chǎn)物先經(jīng)過電泳確認,然后再對擴增產(chǎn)物進行純化,測序,最后對測序得到的基因序列進行比對分析。結(jié)果：1.400名無償獻血者樣本血清學(xué)定型結(jié)果顯示包含9種表型,并從400名無償獻血者樣本中篩選得到弱表達的樣本7例。2. PCR-SSP方法得到400例無償獻血者樣本(包括7例弱表達樣本)的基因型均與血清學(xué)相符；D--個體定型結(jié)果顯示：RHCE基因型是DC-,與血清學(xué)定型結(jié)果(D--)不符。陰性樣本基因定型結(jié)果(dccee)亦與血清學(xué)結(jié)果相符。3.測序結(jié)果顯示：400例無償獻血者樣本中399例(包括6例弱表達樣本,分別是4例弱e、1例弱c和E及1例弱E)的RHCE基因外顯子序列與正常RHCE基因序列沒有差異,1例表型Ccee(弱c)的樣本的第7外顯子存在一處變異,即1059GA (Genbank注冊號：KT957625),該突變導(dǎo)致氨基酸W353*替換。D--個體測序結(jié)果：PCR擴增和測序結(jié)果顯示缺失第3、4和第5外顯子,其他外顯子測序結(jié)果未發(fā)現(xiàn)變異。PCR-SSP定型結(jié)果顯示RHC陽性(DC-)。弱E樣本觀察到第5外顯子存在一處突變(762GC),綜上,D--測序結(jié)果提示該個體攜帶一種新的由RHCEIRHD基因交換形成的等位基因RHCE-D(3-5)-CE.結(jié)論：1. RHCE基因編碼區(qū)全長測序方法能在統(tǒng)一的反應(yīng)條件下成功特異性擴增RHCE基因的10個外顯子；2. RHCE基因編碼區(qū)全長測序方法可用于一般實驗室進行RHCE基因測序并能解決臨床中的疑難定型的樣本；3. RHCE基因編碼區(qū)全長測序方法對于長期定期輸血患者以及疑難定型樣本的準確定型及配型輸血具有重要意義,正確的定型是安全輸血的前提,也是減少同種異體抗體產(chǎn)生的重要手段。PART Ⅱ血源性瘧疾檢測的新方法背景：我國目前瘧疾發(fā)病人數(shù)呈逐年下降趨勢,但隨著我國與東南亞、非洲、南美洲等瘧疾高發(fā)區(qū)的經(jīng)貿(mào)交流日益頻繁,瘧疾的防治形勢依然嚴峻。據(jù)WHO發(fā)布的最新情況,2013年仍有共計約1.98億瘧疾患者,其中有58.4萬人死亡[6]。白1911年Woolsey報道首例輸血性瘧疾后,世界各地均有輸血性瘧疾的報道。輸血作為各種疾病治療措施的應(yīng)用逐年增多,加之在獻血員的篩選試驗中,很多國家還沒有把瘧疾的檢測作為常規(guī)的必查項目,由輸血引起的瘧疾時有發(fā)生,不僅會加重患者病情,而且給臨床輸血安全帶來了隱患。近年來,陸續(xù)在北京、廣東、浙江、江蘇、四川等地發(fā)現(xiàn)入境及歸國人員感染瘧疾的病例及死亡個例,使得我國輸血性瘧疾感染的風(fēng)險逐漸升高。感染人類的瘧原蟲有5種,分別是惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵型瘧原蟲和諾氏瘧原蟲,其中惡性瘧最常見且致死率最高。瘧原蟲的雌、雄配子在按蚊蟲體內(nèi)結(jié)合發(fā)育完成后通過叮咬侵入人體,瘧原蟲早期寄生在肝細胞中,后期主要寄生在紅細胞內(nèi)。瘧原蟲在宿主紅細胞內(nèi)以血紅蛋白中的珠蛋白部分為營養(yǎng)來源,而血紅蛋白的血紅素部分則釋放出來成為游離血紅素,為避免游離血紅素對瘧原蟲自身的殺傷作用,瘧原蟲將游離血紅素轉(zhuǎn)化成不可溶的高鐵血紅素結(jié)晶,即瘧色素。瘧色素是在瘧原蟲食物泡內(nèi)合成的,并隨著瘧原蟲感染紅細胞(Plasmodium infected red cell, iRBC)的破裂而釋放到血漿中,其中大部分被吞噬細胞所吞噬。由此可見,瘧疾患者的紅細胞、血清和吞噬細胞中均存在瘧色素。目前已有瘧疾的檢測方法主要可以分為三類,一是血涂片鏡檢,血涂片吉姆薩染色后光學(xué)顯微鏡下檢測,以是否觀察到紅細胞內(nèi)期瘧原蟲為判斷的標準,此方法仍然是目前瘧疾檢測的“金標準”,其操作簡便所需儀器少,但存在耗時長且對實驗人員經(jīng)驗要求高等缺點,二是抗原抗體檢測,以抗原抗體特異性結(jié)合的原理發(fā)展了許多種檢測方法,如酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),免疫膠體金,電化學(xué)發(fā)光等瘧疾抗原抗體的檢測方法,此類方法操作檢測快捷,但存在一定程度的假陰性,且靈敏性較差,三是核酸檢測,以PCR為代表的瘧疾特異性核酸片段的檢測,其靈敏性大大提高,但由于其所需實驗條件較高而難以推廣使用。拉曼光譜技術(shù)是一門涉及光學(xué)、物理學(xué)、材料學(xué)和計算機等學(xué)科的綜合交叉技術(shù),它的基本原理是：一束單色光入射介質(zhì)后會出現(xiàn)透射、吸收、散射3種情況,散射光中的大部分波長與入射光相同,稱為瑞利散射,而一小部分由于介質(zhì)中分子振動和分子轉(zhuǎn)動的作用使波長發(fā)生偏移,稱為拉曼散射,通過分析拉曼光譜特征峰位置、強度和線寬提供分子振動、轉(zhuǎn)動方面的信息,據(jù)此可以反映出分子中不同的化學(xué)鍵或官能團,因此拉曼光譜成為研究物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的有效手段。拉曼光譜技術(shù)具有以下兩個優(yōu)勢,一是無損,拉曼光譜技術(shù)是一種無損傷檢測的新技術(shù),生命科學(xué)領(lǐng)域的研究對象主要有核酸、蛋白、糖類和脂類。拉曼激光的光子能量低,不會對其產(chǎn)生有損傷作用的電離,特別適用于細胞和組織的檢測。拉曼光譜技術(shù)所需樣品量非常少,樣本無需進行染色或去除雜質(zhì)等處理,液體固體均可,甚至活細胞原位也能進行檢測,而且檢測后對樣本無影響,這可避免常規(guī)檢測手段樣本處理過程中待檢物的損失和待檢物理化性質(zhì)的改變,二是光譜的特異性,每一種物質(zhì)均具有拉曼光譜指紋特征,即特征峰,拉曼光譜對核酸、蛋白、糖類和脂類等的生物大分子構(gòu)象特別敏感,能夠探測到物質(zhì)內(nèi)構(gòu)象的細微變化,這對分析生理和(或)病理狀態(tài)下生物大分子的組成和結(jié)構(gòu)差異具有優(yōu)勢。目的：本研究旨在建立高靈敏、高特異性的拉曼光譜檢測平臺,為瘧疾檢測提供一種新的準確、簡便、敏感的方法。方法：1.研究對象和材料實驗樣品包括制備的p-血色素、體外培養(yǎng)惡性瘧原蟲感染紅細胞、不同蟲血率下(10%,5%,2.5%,1%,O.5%和0.01%)的瘧色素提取物、正常未感染新鮮紅細胞。2.實驗方法(1)瘧原蟲培養(yǎng)：瘧原蟲蟲株是惡性瘧原蟲3D7,采用37℃、5%CO2連續(xù)培養(yǎng)。(2) β-hematin合成與拉曼光譜檢測：β-hematin的合成采用的是酸萃取法,將合成的β-hematin粉末均勻的涂抹在玻片上,檢測儀器為顯微共聚焦拉曼光譜儀。(3)瘧色素的提取與拉曼光譜檢測：瘧色素的檢測分為瘧色素提取物檢測和瘧色素原位檢測,瘧色素的提取采用的是皂素溶液裂解宿主紅細胞釋放的方法�？焖俪上裣到y(tǒng)用于原位檢測,顯微共聚焦拉曼光譜儀用于瘧色素提取物檢測。(4)SERS在瘧色素檢測中的應(yīng)用：兩種不同材料的表面增強材料用于增強瘧色素的拉曼信號�？焖俪上裣到y(tǒng)用于iRBC的拉曼成像。結(jié)果：1.獲得了瘧原蟲感染后產(chǎn)生瘧色素的特征拉曼光譜,瘧色素與P-hematin(陽性對照)具有相似的特征峰,且兩者的拉曼光譜峰穩(wěn)定一致。2. iRBC和nRBC血涂片檢測結(jié)果顯示,拉曼光譜峰相對強度的變異系數(shù)小于20%,相對位移的變異系數(shù)小于1%,兩者具有良好的一致性,即血涂片下顯微拉曼光譜檢測不能區(qū)分正常紅細胞和瘧原蟲感染紅細胞。3. 建立了iRBC的瘧色素提取方法,瘧色素與血紅蛋白可實現(xiàn)有效的拉曼光譜鑒別,檢測感染率可達O.1%。4.快速拉曼光譜成像儀掃描可疑iRBC和nRBC,得到的光譜以1372cm-1峰強作為拉曼成像的參照峰,做出的瘧色素分布圖與光鏡下瘧色素空間分布相同,即瘧原蟲紅細胞原位掃描成像與光鏡下的瘧色素空間分布具有良好的一致性。結(jié)論：1.拉曼光譜技術(shù)能用于瘧原蟲的檢測,能成功獲得瘧色素的特征峰,能成功鑒別瘧疾感染紅細胞和正常紅細胞。2.瘧色素提取濃縮物與β-血色素(陽性對照)的拉曼光譜具有良好一致性,與正常血紅蛋白(陰性對照)存在明顯差異,瘧色素提取方法能使檢測靈敏度達到0.1%的蟲血率。3.感染瘧原蟲紅細胞原位掃描能獲得清晰的瘧色素分布圖且能鑒定食物泡和蟲體,并可用于鑒定宿主紅細胞內(nèi)瘧色素分布的位置以及檢測相對含量。
【關(guān)鍵詞】：基因序列分析D--弱抗原瘧疾拉曼光譜
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R531.3
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-27
• PARTⅠ RHCE基因編碼區(qū)測序技術(shù)27-47
• 1 材料27-28
• 1.1 樣本27
• 1.2 主要試劑27
• 1.3 主要儀器27-28
• 1.4 主要溶液的配制28
• 1.5 引物合成28
• 2 方法28-34
• 2.1 Rh血型表型血清學(xué)分型28-29
• 2.2 RHCE基因型分型檢測29-31
• 2.3 RHCE基因測序方法的建立31-34
• 3 結(jié)果34-44
• 3.1 血清學(xué)測定34-36
• 3.2 RHCE基因分型36-38
• 3.3 RHCE基因測序38-44
• 4 討論44-46
• 5 小結(jié)46-47
• PARTⅡ 血源性瘧疾檢測的新方法47-67
• 1 材料47-48
• 1.1 研究樣品47
• 1.2 主要試劑47
• 1.3 主要儀器47
• 1.4 主要溶液配制47-48
• 1.5 光譜處理48
• 2 方法48-52
• 2.1 瘧原蟲的培養(yǎng)及血涂片檢測48-49
• 2.2 拉曼光譜儀參數(shù)調(diào)節(jié)及數(shù)據(jù)處理49-50
• 2.3 β-血色素的合成及拉曼光譜檢測50
• 2.4 瘧色素的拉曼光譜檢測50-51
• 2.5 SERS及快速成像在瘧疾檢測中的應(yīng)用51-52
• 3 結(jié)果52-63
• 3.1 瘧原蟲培養(yǎng)及拉曼檢測52-53
• 3.2 β-血色素的拉曼光譜53-54
• 3.3 瘧色素的拉曼光譜54-61
• 3.4 SERS及快速成像的應(yīng)用效果61-63
• 4 討論63-66
• 5 小結(jié)66-67
• 參考文獻67-74
• 附錄74-75
• 縮略詞75-76
• 攻讀學(xué)位期間成果76-77
• 致謝77-78

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4 易品;RHCE基因編碼區(qū)測序技術(shù)及血源性瘧疾檢測的新方法[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

5 蘇永強;應(yīng)用遙感與地理信息系統(tǒng)技術(shù)研究海南省瘧疾分布特征及其環(huán)境影響因素[D];中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué);2003年

6 徐其章;緬甸佤邦北部佤族區(qū)瘧疾感染和就醫(yī)行為及其影響因素研究[D];大理學(xué)院;2010年

7 唐克香;磷酸萘酚喹預(yù)防瘧疾Ⅲ期臨床試驗[D];大理學(xué)院;2012年

8 王麗麗;中緬邊境居民瘧疾知識、態(tài)度、行為調(diào)查及影響因素研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2013年

9 張瑜;云南邊境地區(qū)瘧疾感染危險因素病例對照研究[D];大理學(xué)院;2013年

10 區(qū)德錦;瘧疾動物模型血小板動態(tài)變化及不同藥物干預(yù)觀察研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

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本文編號：1106643