發(fā)布時間：2017-10-05 12:39

  本文關鍵詞：條件性Smad4基因敲除鼠模型的建立和鑒定及初步表型

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【摘要】：目的:利用Cre/LoxP系統(tǒng)建立眼組織特異性Smad4基因敲除小鼠并進行初步表型分析。方法:通過PAX6啟動子驅(qū)動的Cre轉(zhuǎn)基因小鼠(Le-Cre)作為介導敲除的工具鼠,將其與Smad4條件基因小鼠(Smad4fl/fl)結(jié)合獲得Le-Cre特異性Smad4基因敲除小鼠或變異小鼠(Le-Cre;Smad4fl/fl)。為了證實條件性基因敲除的特異性及有效性,通過PCR技術(shù)對小鼠或鼠胚進行了相關基因分析,特定組織綠色熒光蛋白(GFP)的表達及Smad4蛋白的檢測,同時利用ROSA26報導基因小鼠藉LacZ染色顯示Le-Cre在眼組織的表達;并對Smad4變異小鼠的表型進行了觀察。結(jié)果:早在E10.0左右,鼠胚晶狀體位置及眼周外胚層發(fā)現(xiàn)強熒光的GFP表達,表明Le-Cre明確出現(xiàn)在特定的靶組織。通過小鼠基因型分析,確定了小鼠或鼠胚是否攜帶Cre重組酶基因、Smad4條件性等位基因和/或Rosa報導基因,對小鼠晶體DNA的基因分析也證實Smad4基因在某些特異性眼組織內(nèi)得到剔除。通過在Cre轉(zhuǎn)基因小鼠導入報導基因,并籍LacZ染色對Cre重組酶的表達進行檢測,顯示了Cre重組酶的時空表達及其表達的組織特異性。Smad4免疫組化染色顯示,在正常發(fā)育胚鼠眼可見廣泛的Smad4表達,早期主要存在于胞漿,隨著胚眼發(fā)育向核內(nèi)轉(zhuǎn)移;而在Smad4變異鼠胚眼,結(jié)果表明Smad4在Cre重組酶所表達的組織內(nèi)缺乏表達。觀察發(fā)現(xiàn)Smad4變異鼠可以順利存活,但表現(xiàn)出眼球縮小、眼窩凹陷、眼瞼畸形開放、閉合不能及眼周毛發(fā)脫失的外觀。結(jié)論:通過基因和蛋白水平的檢測證實了Le-Cre;Smad4基因敲除鼠的建立及Smad4在變異小鼠中表達的缺乏。Smad4在眼組織的敲除導致了眼及附屬器的明顯異常,為深入了解眼球發(fā)育及Smad4對其影響的機制提供了一個可信的動物模型。
【作者單位】： 長沙愛爾眼科醫(yī)院;
【關鍵詞】： Smad 條件性基因敲除 Le-Cre 報告基因 眼表型
【分類號】：R-332
【正文快照】： 0引言 Smad4是Smads家族成員之一?,是轉(zhuǎn)導TGF-p倍號 的重要胞漿內(nèi)信號級聯(lián)分子,它與活化的受體激活型Smad4分子形成復合物,移位至細胞核,與其它轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用,調(diào)節(jié)TGF-p丨、V:答JiW的轉(zhuǎn)錄Ml。Smad4基因 被完全敲除后導致動物在胚胎期即死亡121,因此無法對其展開進一步的研

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本文編號：976860